全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白(β-Ⅲ-Tubulin)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。

改良差速贴壁＋无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是最适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准。目的：运用改良差速贴壁法＋含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法。设计、时间和地点：观察性对照实验。实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成。材料：健康成年SD大鼠6只,体质量150-180g。方法：①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁＋无血清条件培养液纯化的实验。②单纯改良差速贴壁：将单细胞混悬液以8000个/cm^2密度种植于无包被的25cm2培养瓶中。经12h＋24h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×10^9L^-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35mm培养皿中继续培养3周。③单纯无血清条件培养液纯化：将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周。④改良差速贴壁＋无血清条件培养液纯化：经12h＋24h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0-3.0d后,改换成无血清条件培养液,孵育36-48h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养。以后视情况每3-5d半量换液1次,培养3周。主要观察指标：运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征。采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度。结果：①倒置显微镜观察：差速后3d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难。差速后再运用无血清条件培养液2d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长。伴少量扁平状＂油煎蛋样＂细胞。继续培养至14d可见细胞立体感及折光性最佳,数量和纯度最高。培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间。②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%-75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%-52%,改良差速贴壁＋无血清条件培养液纯化组纯度可达88%-92%。结论：实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法。