小鼠胚胎干细胞与复合丝素膜的生物相容性研究

探索胚胎干细胞与丝素材料结合的可行性及生物相容性,建立一套在丝素膜上小鼠胚胎干细胞的体外培养体系。通过形态观察、MTT比色法、克隆形成率分析、碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色、核型分析等方法,研究丝素膜对小鼠胚胎干细胞的黏附、生长情况、未分化状态的维持、胚胎干细胞特性、遗传、分化等方面的影响。结果显示,两者之间具有良好的生物相容性,丝素膜材料支持小鼠胚胎干细胞的体外无限扩增和未分化特征,并保持其正常核型。证实丝素材料可作为胚胎干细胞结合的良好生物材料。

同种异体血清在体外培养骨髓间充质干细胞的作用研究

[目的]适当的血清浓度可维持骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养,血清浓度过低不利于细胞的生长,而高浓度血清则易引起细胞分化。而血清的不同来源对MSCs的培养同样产生影响。传统的培养方法用胎牛血清作为营养支持,临床应用时存在潜在的风险。本研究探讨同种异体血清在体外培养人骨髓间充质干细胞(hBM-SCs)的可行性。[方法]无菌条件下收集人骨髓悬液,分离hBMSCs,分别用含胎牛血清和人血清的培养基培养。分别测定2种方法培养的hBMSCs细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测分析培养的hBMSCs表面抗原类型;并将培养的hBMSCs诱导分化为软骨细胞及神经细胞,诱导后的软骨细胞及神经细胞采用免疫组化染色分析。[结果]2种方法培养的间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性,表达强度无显著性差异;人血清培养的hBMSCs细胞生长速度快于胎牛血清培养组,但分化效率低于后者。[结论]通过生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,人血清培养hBMSCs与胎牛血清培养差别不大,可以作为一种适合临床的安全培养方法。

干细胞分化抗原及标记物研究进展

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,现在已经有一些分化抗原或膜分子作为干细胞的标记物,以用于鉴定和分离干细胞,但至今尚未找到特异的干细胞标记物。干细胞的鉴定还需依赖多个指标综合分析,同时需致力研究和寻找干细胞的特异标记。

经静脉移植人脐血间充质干细胞在鼠损伤脊髓的表达及神经功能修复

目的:采用Brdu免疫组化标记技术观察经静脉移植人脐血间充质干细胞进入损伤脊髓组织的表达情况,探讨其促进损伤脊髓神经功能恢复的作用。方法:实验于2003-10/2005-03在苏州大学生物技术研究所干细胞实验室完成。①选取健康成年Wistar大鼠60只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组,20只/组。脐血标本来自苏州大学附属第一医院产科,产妇及其家属均签署知情同意书。②自脐带抽取新鲜脐带血50～60mL,分离培养人脐血间充质干细胞,调整细胞浓度为5×109L-1待用。在细胞移植前48h,体外进行Brdu标记。③模型对照组、干细胞移植组大鼠采用重物压迫法建立脊髓损伤模型。麻醉后取俯卧位,于T11节段处行背后方正中切口,剥离椎旁肌,咬除T11棘突及椎板,显露4mm×5mm硬脊膜,将55g重砝码放置于硬脊膜表面1min,然后逐层缝合伤口。假手术组仅显露硬脊膜,然后缝合伤口。④造模后5d,干细胞移植组大鼠自后肢大隐静脉缓缓注入人脐血间充质干细胞悬液0.2mL～0.3mL(1×106个)。模型对照组、假手术组给予等量生理盐水。⑤分别于细胞移植后1d、1,2,3周,采用BassoBeatlieBresnahan(BBB)评分法和斜板试验法测定各组神经功能情况。于细胞移植后1,3周制作冰冻切片,检测各组脊髓组织内脐血间充质干细胞的分布情况。结果:①神经功能检测结果:脊髓损伤细胞移植后3周内,模型对照组、干细胞移植组大鼠后肢运动功能均有所恢复,但干细胞移植组恢复较快,于术后1周BBB评分和斜板试验结果即明显优于模型对照组[(10.71±6.24),(5.13±3.36)分,t=2.39,P<0.05;(51.67±5.22),(46.63±3.72)度,t=3.39,P<0.01],并维持至术后3周[(17.29±4.03),(11.25±5.01)分,t=3.89,P<0.01;(65.77±8.06),(57.05±4.61)度,t=4.07,P<0.01]。②脊髓组织中人脐血干细胞的鉴定:假手术组、模型对照组脊髓组织中未见Brdu阳性表达区。干细胞移植组于移植后1周脊髓损伤区可见大量棕褐色Brdu阳性表达的人脐血间充质干细胞存在,并持续至移植后3周,而非损伤区则始终无阳性表达。结论:Brdu对脐血间充质干细胞具有良好的标记作用,经静脉移植的人脐血间充质干细胞能够进入脊髓损伤区,并可以促进损伤脊髓神经功能的修复。

人CD133基因转染细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

目的:构建人干细胞标记分子CD133-2转基因细胞并探讨CD133-2分子的生物学功能。方法:利用分段克隆和重叠PCR方法从人胎肝cDNA文库中克隆出人CD133-2全长基因,经双酶切后装入真核表达载体p IRES2-EGFP中,用脂质体法转染L929细胞,加入G418选择性培养基进行筛选。经RT-PCR、Western blot、流式细胞术(FCM)等方法鉴定转基因细胞;MTT法分析转基因细胞对T细胞的体外增殖作用;流式细胞仪分析T细胞表面活化分子标记CD4CD25、CD8CD25的表达。结果:成功克隆和构建了能稳定表达人CD133-2分子的转基因细胞CD133-2/L929,该转基因细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖,下调T细胞表面分子CD4CD25和CD8CD25的表达。结论:稳定表达CD133-2蛋白的转基因细胞株的建立为该基因功能的后续研究奠定了物质基础。

干细胞在脂肪组织工程中的应用

目的:脂肪组织再生的关键因素在于种子细胞,深入认识脂肪组织工程的现状,分析和展望干细胞在脂肪组织工程中的作用。资料来源:应用计算机检索PUBMED 1996-01/2006-06的相关文章,检索词为"stem cells,adipose tissue engineering",并限定文章语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与干细胞在脂肪组织工程中的应用相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到209相关文献,98文献符合纳入标准,排除的111篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的98篇文献中,分别涉及脂肪组织中的细胞组成、脂肪组织工程的现状、干细胞的来源以及在脂肪组织工程中的应用等内容。资料综合:软组织挫伤、肿瘤及先天畸形等都可能造成大量脂肪组织的缺失从而导致软组织缺损,种子细胞的选择、支架材料、细胞生存环境、将细胞重新植入损伤部位的方法是重建缺损软组织的重要环节。迄今为止,依然没有一种理想的在任何情况下都适用的填充材料,而利用自体脂肪组织移植来治疗软组织缺损的方法尚不成熟。脂肪组织再生的关键因素就是种子细胞,干细胞因其自我复制、自我更新、多能分化的特点成为目前较理想的种子细胞。结论:前脂细胞和脂细胞移植是软组织重建的可行方法,而干细胞诱导生成脂肪组织应用于软组织重建虽然面临伦理和科技上的障碍,但由于它蕴含着巨大的潜力,有望成为推动脂肪组织工程发展的革命性力量。

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景:现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件,及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。设计、时间及地点:细胞形态学观察及蛋白分子水平检测,于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。材料:清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品,成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amresco产品。方法:Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞密度为5×107L-1。设立2组,诱导组用含10%胎牛血清和10μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24h后,再以含2%二甲基亚砜和200μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1,3,5h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。主要观察指标:细胞形态学变化,免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。结果:预诱导24h,胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形,伸出多个短棒状突起,可见2～3个核仁,细胞间漩涡状生长趋势消失,排列无规律;诱导1～3h,细胞逐渐变圆,胞质收缩明显,折光性增强,双级或多极的突起互相连接呈网状;诱导5h,突起出现一、二级分支。诱导1h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白;3h后巢蛋白达高峰,同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白;5h后巢蛋白表达下降,神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化,巢蛋白表达为阴性。结论:在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导,能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化,且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。

丝素蛋白与胎盘间充质干细胞生物相容性的实验研究

目的 探讨丝素蛋白（SF）材料与胎盘间充质干细胞（PMSCs）的生物相容性.方法 运用SF溶液包被的培养瓶培养PMSCs,流式细胞术分析其表型并对其定向分化潜能进行探讨;PMSCs置于SF膜材料培养后通过扫描电镜观察细胞形态变化.结果 用SF溶液包被的培养瓶培养的PMSCs,其生长特性、表面标志、多向分化潜能无明显变化;PMSCs在SF膜材料上生长良好,培养8 d时材料上细胞伸展增殖,分泌大量颗粒状、网状基质物质,材料间隙被基质填满.结论 SF材料不影响PMSCs的生长特性、表面标志和多向分化潜能,具有良好的生物相容性.

丝素蛋白复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究

目的 探讨丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨组织修复兔桡骨的节段性骨缺损的可行性.方法 分离培养兔骨髓间充质干细胞,与丝素蛋白膜材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况.将24只新西兰大白兔制成桡骨中段1.5cm长的骨缺损模型,随机分为3组:实验组(植入细胞材料复合物)、对照组(单纯植入丝素蛋白材料)、空白组(不植入修复材料).术后2,4,8,12周分别行大体观察、组织学观察和X线观察,比较3组骨缺损修复的情况.结果 骨髓间充质干细胞在丝素蛋白膜材料上生长情况良好.术后2,4,8,12周放射学检查新骨生成以及组织学检查新骨生成情况,实验组均优于对照组,空白组各时点均无新骨形成.结论 丝素蛋白材料与骨髓间充质干细胞体外复合培养构建的组织工程化骨能够修复兔桡骨缺损,可以作为组织工程骨的支架材料的全新来源.

无血清培养条件下神经元前体细胞的增殖

目的:建立新生大鼠大脑皮层细胞原代培养体系并进行神经元前体细胞的增殖研究。方法:原代混合培养新生大鼠大脑皮层细胞;混合培养体系用血清培养基培养6d后换用无血清培养基培养,免疫细胞化学显色鉴定此培养过程中不同时间点的细胞类型,并在不同时间段加入BrdU,用于分析神经元前体细胞的增殖状况。结果:换用无血清培养基培养后,出现明显的细胞分层现象;神经元及其前体细胞的比例逐渐上升,而神经干细胞和星形胶质细胞的比例缓慢下降;增殖细胞的比例在0～24h、24～48h、48～72h时间段里逐渐增加,而在72～96h、96～120h时间段里逐渐减少。结论:新生大鼠大脑皮层细胞混合培养体系在无血清培养条件下促进神经元前体细胞的增殖。

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。

丝素蛋白在组织工程中的应用

目的:总结丝素蛋白在生物材料和组织工程领域的应用,分析和展望丝素蛋白材料在医学生物领域的应用前景。资料来源:应用计算机检索PUBMED 1993-01/2007-01关于丝素蛋白和组织工程的文章。检索词为“silk,tissue engineering”,并限定文章的语言种类为English。同时利用计算机检索中国期刊全文数据库1994-01/2007-01的相关文章,限定文章语言种类为中文,检索词为“丝素蛋白、组织工程”。资料选择:对资料进行初审,纳入标准:①丝素蛋白的性质、在组织工程中的应用。②骨髓间充质干细胞与丝素蛋白复合的相关性研究。③丝素蛋白的改性、修饰在生物学领域的应用。排除标准:重复性研究。资料提炼:共收集到符合上述要求的文献96篇,排除45篇重复性研究。48篇符合纳入标准:其中13篇关于丝素蛋白的结构和性质的,7篇关于丝素蛋白表面修饰的,篇关于丝素蛋白和组织工程的。28资料综合:实验证明丝素蛋白可以多种形式(薄膜、膜、网状结构、海绵状等)在体外支持干细胞的黏附、增殖和分化,体内促进组织的修复,尤其是干细胞组织工程中三维的丝素蛋白支架扩大了丝素作为生物材料的应用,成为最有前景的生物材料之一。结论:丝素蛋白作为一种新的生物材料应用越来越受到关注。而且,通过多种方法改进、表面修饰等技术控制丝素蛋白的分子结构和形态,使得丝素蛋白在生物材料和组织工程领域的应用变得更为广泛。

大鼠骨髓间充质干细胞在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的培养及成神经诱导

目的通过将骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上,研究BMSCs的生长及成神经分化情况。方法用家蚕丝素、柞蚕丝素分别与聚乳酸共混制成静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维,将第5代大鼠BMSCs培养其上,于24h后通过活细胞工作站观察细胞的黏附情况,并进行表型鉴定及存活检测。接种后待细胞长至60%左右,用bFGF/BHA诱导细胞成神经分化,并设多聚赖氨酸组进行对照。在诱导5h和维持48h时,观察细胞的形态学改变,通过免疫荧光法鉴定神经细胞特异性标志物Nestin,β-Ⅲ-Tubulin和NCAM的表达并进行定量统计分析。结果BMSCs在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的黏附情况良好,细胞生长于纳米纤维上。存活检测中几乎未发现死细胞,多数细胞在材料上可存活。神经分化的形态学改变与多聚赖氨酸组一致,并且培养在纳米纤维上的细胞分化时出现的突起可缠绕在纺丝纤维上。神经特异标志的表达情况与多聚赖氨酸对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维具有良好的生物相容性,可支持BMSCs的黏附及成神经分化,且对细胞生存无毒性。