抗CD40单链抗体的慢病毒载体的构建和表达

目的克隆大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv),并构建可表达大鼠抗小鼠的抗CD40抗体的单链抗体(CD40-scFv)的重组慢病毒。方法采用RT-PCR法从分泌大鼠抗小鼠抗CD40激活型抗体的杂交瘤细胞株(FGK-115)中克隆VH和VL基因,用重叠延伸PCR法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD40抗体的scFv基因,将CD40-scFv基因连接至PEGM-T克隆载体,限制性内切酶酶切及测序鉴定;构建含有大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)的慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞;获得病毒颗粒并感染人慢性髓系白血病细胞MEG-01,检测其感染效率。结果含大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)的慢病毒穿梭质粒构建成功;通过磷酸钙感染293T细胞所得病毒上清可成功感染MEG-01细胞,流式细胞术检测阳性率可达96%。结论成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)基因,并建立其重组慢病毒表达系统,为后续的实验及应用研究工作奠定了基础。

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35(IL-35)基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b(+),并转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b(+)-IL-35在BL21(DE3)中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。