Ad-ING4对人前列腺癌细胞PC-3体内外抑癌效应的研究

背景与目的:腺病毒作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗。ING4是生长抑制因子家族中的一个成员,是一种潜在的抑癌基因。本研究旨在探讨腺病毒介导的人ING4基因(Ad-ING4)对人前列腺癌细胞PC-3的体内外抑癌效应及其分子机制。方法:将扩增的Ad-ING4重组腺病毒感染PC-3细胞,用RT-PCR法检测ING4在PC-3细胞中的转录;MTT法检测ING4基因对PC-3细胞增殖的影响;流式细胞术和Hoechst33258染色法检测细胞凋亡的变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因的表达对PC-3细胞中的bcl-2、bax、p53和caspase-3凋亡相关基因表达的影响。用Ad-ING4重组腺病毒在裸鼠PC-3移植瘤的瘤体内注射治疗,观察肿瘤生长变化,15d后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重;用免疫组化法检测瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3和CD34蛋白的表达。结果:腺病毒介导的人ING4基因在PC-3细胞中成功转录,明显抑制PC-3细胞增殖,上调p53、bax、caspase-3基因表达和下调bcl-2基因表达,并诱导细胞凋亡。Ad-ING4重组腺病毒能显著抑制裸鼠PC-3移植瘤的生长,瘤重的抑制率达37%,与空病毒载体Ad-GFP组和细胞对照PBS组比较差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示Ad-ING4重组腺病毒能明显上调Bax和Caspase-3蛋白的表达水平,下调Bcl-2和CD34蛋白的表达水平。结论:腺病毒介导的ING4基因在体内外均可明显抑制人前列腺癌细胞PC-3的生长,诱导其凋亡,其机制可能是上调P53、Bax、Caspase-3蛋白和下调Bcl-2蛋白表达水平。

腺病毒载体介导的ING4基因对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用

目的:用人源化改造的鼠肿瘤生长抑制因子(mING4)基因构建的腺病毒表达载体(Ad-ING4)研究对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用。方法:以pcDNA3.0-mING-4重组质粒为模板,通过基因定点突变技术对mING4基因进行人源化改造,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人ING-4氨基酸序列相同的重组腺病毒子(Ad-ING4),感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING4在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞技术检测ING4基因表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;荧光共聚焦显微镜观察MG-63细胞凋亡的形态学变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因表达对MG-63细胞中的Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果:基因测序和PCR分析结果显示,人源化改造的小鼠ING4分子氨基酸序列与人ING4分子完全相同,成功构建了Ad-ING4腺病毒表达载体,在MG-63细胞中ING4基因的表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,出现典型细胞凋亡形态学变化,ING4基因表达可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡。结论:转染ING4基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2表达水平来发挥抗肿瘤作用的。

物理交联再生丝素膜组织工程角膜的生物相容性研究

背景角膜组织工程生物材料在体内应当具备透明性、一定的机械强度、生物相容性和缓慢降解的特点，丝素膜生物材料具备这些特征。目的研究采用物理交联再生丝素膜构建组织工程角膜的可行性。方法用常规培养法培养人角膜上皮细胞（CECs），将对数生长期的CECs在用家蚕丝制备的物理交联再生丝素膜上进行培养，分别于培养后24、48、72h在倒置显微镜、扫描电子显微镜下观察CECs的生长状态和形态学，并与细胞培养板培养的人CECs形态进行对照。MTT法每日检测和记录再生丝素膜培养后人CECs的增生情况，流式细胞仪检测再生丝素膜培养人CECs的细胞周期和凋亡率。将再生丝素膜4mm×3mm植入新西兰白兔右眼角膜基质层间，于术后1个月、2个月时裂隙灯下检查眼表，术后2个月摘除兔眼并制备移植眼角膜组织切片行组织病理学检查，观察再生丝素膜材料的降解情况及角膜新生血管（CNV）的生长情况。采用免疫组织化学法检测术后1个月、2个月CD34在移植眼角膜组织中的表达，并与正常眼进行对照。结果在24、48、72h3个时间点，倒置显微镜、扫描电子显微镜下见再生丝素膜培养的人CECs与细胞培养板培养法培养的人CECs形态结构无明显差别。再生丝素膜或细胞培养板培养CECs在1、2、3、4、5、6、7d各个时间点A490值比较，差异无统计学意义（F=0．641，P〉0．05）。再生丝素膜和细胞培养板培养的CECs凋亡率分别为1．8％、2．0％，细胞G2／G1期分别为1．956、1．945。再生丝素膜角膜植入后2个月时，再生丝素膜为排列整齐的胶原组织替代，角膜内新生血管和炎性细胞均少于移植后1个月。角膜免疫组织化学染色检测显示再生丝素膜植入角膜后1个月、2个月CD34表达量均明显低于Ad—VEGF165诱导的阳性对照，而与正常的角膜相比差异无统计学意义（P〉0．05）。术后1个月与术后2个月比较，角膜中CD34阳性率的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论物理交联再生丝素膜构建组织工程角膜可行，再生丝素膜与角膜组织生物相容性良好，再生丝素膜植入兔角膜基质后无明显的炎症反应和新生血管。

腺病毒介导的IL-24增强紫杉醇对A549肺腺癌细胞生长的抑制作用

目的探讨腺病毒介导的白细胞介素24(Ad-IL-24)联合紫杉醇对体外培养的人肺腺癌A549细胞生长的影响。方法用Ad-IL-24、紫杉醇、Ad-IL-24联合紫杉醇处理A549细胞,以CCK-8法测定细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化。结果 Ad-IL-24可明显抑制人肺腺癌A549细胞生长并诱导细胞凋亡,与紫杉醇联合处理后,其抑制肺癌细胞生长及诱导细胞凋亡作用明显优于单用紫杉醇组及Ad-IL-24组,并引起G2/M期阻滞。结论 Ad-IL-24感染肺癌A549细胞可增强紫杉醇对肿瘤细胞生长的抑制作用。

腺病毒介导的IL-24表达对PC-3人前列腺癌细胞体内外抑癌效应

目的:研究腺病毒介导的IL-24基因表达对前列腺癌细胞体内外的抑癌效应及分子机制。方法:将扩增的Ad-IL-24感染PC-3细胞,用RT-PCR和Western blot法检测IL-24基因在PC-3细胞中的表达;MTT法检测IL-24基因表达对PC-3细胞的生长影响;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡变化;RT-PCR法检测IL-24基因的表达对PC-3细胞中的Bcl-2、Bax、p53和Caspase3凋亡相关基因表达的影响。用Ad-IL-24在裸鼠PC-3移植瘤的瘤体内注射治疗,通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、CD34等与细胞凋亡和血管形成相关因子的表达。结果:IL-24基因在PC-3细胞中成功表达,对PC-3细胞增殖有明显抑制作用,可上凋p53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2基因表达,进而诱导细胞凋亡。Ad-IL-24能显著抑制裸鼠前列腺癌移植瘤生长,瘤重的抑制率可达54%;免疫组化结果显示Ad-IL-24不仅能明显上调Bax和Caspase-3基因和下调Bcl-2基因表达,而且能引起与血管形成标记基因CD34表达水平下降。结论:腺病毒介导的IL-24基因表达在体内外可明显抑制PC-3细胞的生长,诱导其凋亡。其机制可能与上凋P53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2和CD34基因表达水平有关。

腺病毒介导的白细胞介素24基因对人肺腺癌细胞的放疗增敏作用

目的研究腺病毒介导的白细胞介素24基因(Ad-IL-24)对人肺腺癌细胞SPC-A1体外抑癌效应、放疗增敏作用。方法将Ad-IL-24感染的SPC-A1细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blot)法检测IL-24目的基因在SPC-A1细胞中的转录和表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测磷酸盐缓冲液(PBS)组、腺病毒(Ad-GFP)组、Ad-IL-24组、放疗组、Ad-GFP联合放疗组(Ad+放疗组)及Ad-IL-24联合放疗组(Ad-IL-24+放疗组)对SPC-A1细胞生长抑制作用,流式细胞术(FCM)检测各组SPC-A1细胞生长周期和凋亡率。RT-PCR法检测SPCA1细胞中生存素、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白X(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(bcl-2)凋亡相关因子的表达。结果 Ad-IL-24作用SPC-A1细胞后,目的基因在SPC-A1细胞中成功转录及表达;Ad-IL-24能显著抑制SPC-A1细胞的生长且呈现时间依赖性,Ad-IL-24组(31.1±0.9)%、放疗组(44.4±2.3)%、Ad-IL-24+放疗组(72.4±1.5)%的生长抑制率分别与Ad-GFP组(2.7±1.1)%比较,均差异有统计学意义(P<0.01),且Ad-IL-24+放疗组优于Ad-IL-24组、放疗组(F=314.613,P<0.01),呈现放疗增敏的协同作用(Q=1.172);Ad-IL-24可诱导SPC-A1细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡,Ad-IL-24+放疗组(40.6±3.3)%的细胞凋亡率与Ad-IL-24组(15.4±1.1)%、放疗组(26.3±1.7)%比较,差异有统计学意义(F=87.194,P<0.01),且具有放疗增敏协同作用(Q=1.162)。Ad-IL-24能明显上调促细胞凋亡相关因子bax、Caspase-3,并下调细胞抗凋亡因子bcl-2、生存素的表达,Ad-IL-24+放疗组作用优于Ad-IL-24组、放疗组。结论 Ad-IL-24有放疗增敏的作用,是理想的放疗增敏剂,该作用机制可能与诱导肿瘤细胞阻滞在G2/M期以及促进肿瘤细胞凋亡有关。

Ad-ING4联合放疗抑制肺腺癌SPC-A1细胞移植瘤的生长

目的:研究腺病毒介导的肿瘤生长抑制因子4(inhibitor of growth family 4,ING4)联合放疗对肺腺癌SPC-A1细胞移植瘤生长的抑制作用。方法:制备SPC-A1细胞荷瘤小鼠模型,随机分为PBS组、Ad组、Ad-ING4组、放疗组、Ad-ING4+放疗组。测量各组荷瘤小鼠移植瘤的体积变化,治疗15 d后摘取瘤块,称质量并计算抑瘤率;H-E染色观察瘤体组织细胞的形态学变化,免疫组化法检测瘤体组织中Bax、caspase-3、Bcl-2、VEGF等因子的表达。结果:治疗后第15天SPC-A1移植瘤体积:Ad-ING4组为(1 136.03±151.58)mm3、单纯放疗组为(1 035.67±86.27)mm3、Ad-ING4+放疗组为(743.84±109.06)mm3,联合组可有效抑制肿瘤生长(P<0.01);此外,联合组抑瘤率也显著高于单纯Ad-ING4组或放疗组(69.62%vs 33.17%、35.41%,P<0.01),呈现放疗增敏协同作用(Q=1.22)。免疫组化结果显示,Ad-ING4及其联合放疗组能明显上调Bax、caspase-3等蛋白的表达,下调Bcl-2、VEGF等蛋白的表达,且Ad-ING4+放疗组对这些蛋白表达的调节作用强于Ad-ING4组、单纯放疗组(P<0.01)。结论:Ad-ING4联合放疗可有效抑制肺腺癌SPC-A1细胞移植瘤的生长。

腺病毒介导IL-24基因诱导人脑胶质瘤U87MG细胞的凋亡

目的:研究腺病毒介导IL-24基因表达载体(Ad-IL-24)对人脑胶质瘤U87MG细胞的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:将本科室构建的Ad-IL-24感染U87MG细胞,RT-PCR法检测IL-24基因的表达,MTT法和流式细胞术检测U87MG细胞的生长和凋亡,激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞凋亡的形态学变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2基因mRNA的表达,Western blotting检测caspase-3的活化。结果:Ad-IL-24感染U87MG细胞后,IL-24在U87MG细胞中有明显表达,并抑制U87MG细胞生长、诱导其凋亡、出现典型的凋亡细胞核形态学改变。Ad-IL-24可上调U87MG细胞中Bax基因、下调Bcl-2基因的表达,并诱导caspase-3蛋白的活化。结论:Ad-IL-24可诱导U87MG细胞凋亡,其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达,并活化caspase-3有关。

CD34^+造血干/祖细胞在转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞中的扩增及其移植SCID小鼠的实验研究

目的:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察对CD34+造血干/祖细胞的扩增作用,并研究移植辐射损伤模型SCID小鼠的效果。方法:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果,建立辐射损伤模型SCID小鼠,将扩增后的CD34+造血干/祖细胞经CFDASE荧光标记后移植入SCID小鼠体内,通过RT-PCR和观察荧光标记细胞来检测小鼠内的人源细胞。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞纯度可达(95.6±2.58)%,与饲养层细胞共培养后CD34+造血干/祖细胞可扩增13.2倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,移植入SCID小鼠四周后,仍可见带有荧光标记的人源细胞,RT-PCR证明人源基因Alu的存在。结论:建立的转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且有较高的移植效率和造血活性。

转基因饲养层细胞体外促进脐带血CD34^+ HSPC增殖

目的构建转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,观察其对脐带血CD34+HSPC的扩增作用。方法用分子生物学技术建立转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,免疫磁珠法分离脐带血CD34+HSPC,将其与饲养层细胞共培养7 d后,流式细胞术检测其增殖,将扩增后染色的CD34+细胞移植入SC ID小鼠体内,应用荧光显微镜和RT-PCR法观察移植效果。结果CD34+HSPC与饲养层细胞共培养后扩增了9.4倍,其表面归巢相关分子CXCR4和CD54阳性率仍较高,植入小鼠体内4周后,可成功归巢到小鼠骨髓。结论建立的转hOSM基因饲养层细胞可以有效地扩增CD34+HSPC,并维持其较高的移植效率和造血活性。

Ad.RGD-ING4-PTEN对神经胶质瘤U87细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨经RGD修饰的生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因与第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)双基因共表达的腺病毒载体(Ad.RGD-ING4-PTEN)体外对神经胶质瘤U87细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响。方法:以Ad.RGD-ING4-PTEN为实验组,Ad.RGD-ING4/-PTEN为单基因对照组,PBS、Ad.RGD/Ad-GFP为空白对照组,分别体外感染U87神经胶质瘤细胞。Western blotting检测目的基因ING4和PTEN在U87细胞中的表达,MTT法检测实验组病毒感染对U87细胞增殖的影响,流式细胞术及Real-time PCR法检测神经胶质瘤细胞凋亡及凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、caspase-3、HIF-1α)表达变化,划痕实验及Transwell实验检测实验组病毒感染对U87细胞迁移及侵袭能力的影响,Real-time PCR法检测侵袭相关基因(MMP-2、MMP-9)表达变化。结果:成功检测到ING4和PTEN仅在实验组及相应单基因对照组中表达。实验组第5天细胞抑制率可达(83.1±4.6)%、凋亡率可达(40.7±4.3)%,与单基因组及空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);实验组能明显上调U87细胞中Bax、caspase-3和下调HIF-1α、Bcl-2等细胞凋亡相关蛋白的表达(均P<0.05),而且肿瘤侵袭相关分子MMP-2、MMP-9的表达也明显下调(均P<0.05);实验组细胞迁移距离[(70.1±6.2)μm]和穿膜细胞数[(26.6±3.5)个]均明显减少,与单基因组及空白对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:与单基因腺病毒相比,Ad.RGD-ING4-PTEN双基因具有更显著的抑制U87神经胶质瘤细胞增殖、诱导其凋亡,并抑制其迁移及侵袭能力。

非传统型前折叠束RPB5交互因子在肝癌HepG2细胞中的生物学功能及其分子机制

目的 探讨非传统型前折叠束RPB5交互因子（URI）对肝癌HepG2细胞生物学功能的影响及其分子机制.方法 设计并构建URI真核表达和URI shRNA干扰载体,转染肝癌HepG2细胞并筛选稳定转染细胞株.采用CCK-8实验和软琼脂克隆形成实验检测各组细胞的增殖能力和体外锚定非依赖性生长的能力,采用流式细胞仪检测γ射线照射后各组细胞的细胞周期和细胞凋亡,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达量.结果 成功构建了URI表达质粒和干扰质粒,并获得相应的稳定转染细胞株.HepG2组、pCDNA3.1-URI-HepG2组和pGPU6-URIi-HepG2组细胞转染第7天相对于第1天的增殖促进率分别为（588.78±32.12）％、（959.33±58.80）％和（393.93±39.70）％,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.HepG2组、pCDNA3.1-URI-HepG2组和pGPU6-URIi-HepG2组的克隆数分别为（43±7）个、（85±5）个和（20±4）个,差异有统计学意义（P＜0.05）.γ射线照射后,pCDNA3.1-URI-HepG2组细胞凋亡和G2/M期阻滞较HepG2组明显降低（P＜0.05）,pGPU6-URIi-HepG2组细胞凋亡和G2/M期阻滞较HepG2组明显升高（P＜0.05）.Western blot结果显示,HepG2细胞的URI、Bax和Bcl-2蛋白相对表达水平分别为0.92±0.03、1.11±0.13和0.82±0.01,pCDNA3.1-URI-HepG2组细胞的URI、Bax和Bcl-2蛋白相对表达水平分别为1.79±0.12、0.48±0.01和2.20±0.30,pGPU6-URli-HepG2组细胞的URI、Bax和Bcl-2蛋白相对表达水平分别为0.50±0.04、1.52 ±0.20和0.38±0.01.pCDNA3.1-URI-HepG2组细胞凋亡相关蛋白Bax表达水平低于HepG2组,Bcl-2蛋白表达水平高于HepG2组;pGPU6-URIi-HepG2组细胞Bax蛋白表达水平高于HepG2组,Bcl-2蛋白表达水平低于HepG2组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 URI能够通过促进细胞增殖和抵抗细胞凋亡来促进肝癌细胞的生长.而干扰URI表达后,肝癌细胞的增殖能力被抑制,细胞抵抗γ射线照射的能力降低,URI可能成为肝癌治疗的新靶点。

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的利用RGD修饰改造白血病抑制因子(LIF)和白细胞介素-24(IL-24)双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL-24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-Anexin V/7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2%和31.5%,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5%,优于单基因组,差异均有统计学意义(P<0.05)。凋亡检测显示,与PBS组(4.5%)和空病毒组Ad.RGD(7.4%)比较,Ad.RGD-IL24(20.9%)、Ad.RGD-LIF(17.8%)均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组(29.7%)的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论 LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。

Ad-hOSM转基因饲养层细胞对脐血CD34^+造血干/祖细胞增殖及归巢能力的影响

目的:建立转人抑瘤素M(hOSM)基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞扩增的影响,比较扩增前、后造血干/祖细胞体外迁移能力的变化。方法:建立转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术(FCM)检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,FCM检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验(Transwell实验)检测自发迁移率和SDF-1诱导迁移率以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞纯度可达(96.8±2.28)%,与Ad-hOSM转基因饲养层细胞共培养7 d后CD34+造血干/祖细胞可扩增15.73倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,培养后的细胞用Tran-swell板做体外迁移实验,与转基因饲养层细胞共培养的干细胞,其诱导迁移率为(40.68±1.35)%,明显高于对照组,可以较好的保持其归巢能力。结论:转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。

Ad-hIL-24体外诱导喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

目的研究腺病毒介导的人白细胞介素-24(hIL-24)基因选择性诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-hIL-24)感染喉癌细胞Hep-2,并以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照,采用RT-PCR法检测Hep-2、WI-38细胞中外源性hIL-24基因表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)及流式细胞术等方法检测细胞的生长和凋亡情况。结果腺病毒介导的hIL-24基因能在Hep-2细胞和WI-38细胞中表达;MTT法显示Ad-hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长,LSCM观察结果表明Ad-hIL-24能促进喉癌细胞Hep-2凋亡,流式细胞术显示Hep-2细胞经Ad-hIL-24感染48h后凋亡率为18.47%,G2/M期细胞百分比为38.9%,显著高于PBS组、Ad-GFP组和WI-38细胞,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论Ad-hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。

转白血病抑制因子基因人胚肺成纤维细胞对脐血CD34^+细胞体外扩增的影响

背景:单份脐血的造血细胞数量有限,难以满足成人的需要,如何有效地扩增脐血造血干/祖细胞是目前研究的热点。目的:构建人白血病抑制因子基因修饰的人胚肺成纤维细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞体外扩增的影响。方法:建立转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞,用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验检测自发迁移率和基质细胞衍生因子1诱导迁移试验以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果与结论:成功建立转基因饲养层细胞,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,与人白血病抑制因子转基因饲养层细胞共培养7d后CD34+造血干/祖细胞可大量扩增,同时表面黏附分子的表达量仍较高。体外迁移实验显示与转基因饲养层细胞共培养的造血细胞的诱导迁移率明显高于对照组,可以较好地保持其归巢能力。因此转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。

腺病毒介导的ING4基因对人膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制

目的 探讨腺病毒介导的人生长抑制因子4（ING4）基因对人膀胱移行细胞癌T24细胞体外抑癌效应及其分子机制.方法 将含ING4的重组腺病毒（Ad-ING4）转染T24细胞,以空载体组、未转染组细胞作对照.应用半定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法检测各组ING4基因及蛋白质在T24细胞中的表达 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组T24细胞生长情况 流式细胞术（FCM）和Hochest 33258染色法检测各组T24细胞凋亡变化 半定量RT-PCR法检测各组细胞中凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x（Bax）、p53、缺氧诱导因子（HIF）1α和半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达 Western印迹法检测各组细胞中caspase-3蛋白的表达.结果 腺病毒介导的ING4基因在T24细胞中成功表达,能明显诱导T24细胞凋亡,其凋亡率可达17.2%±4.1%,高于空载体组（4.7%±1.2%）和未转染组（4.8%±1.2%,P〈0.05） 外源性ING4基因可引起T24细胞中p53、Bax基因表达上凋（1.40±0.11比0.27±0.04,1.50±0.12比0.60±0.05）和Bcl-2、HIF-1α基因表达下凋（0.19±0.02比1.20±0.08,0.33±0.03比0.98±0.06,均P〈0.05）,并促进caspase-3活化.结论 腺病毒介导的ING4基因在体外可通过上凋p53、Bax/Bcl-2基因和下凋HIF-1α基因表达,导致caspase-3的活化而抑制人膀胱移行细胞癌T24细胞的生长,并诱导其凋亡.

腺病毒介导的ING4对裸鼠人骨肉瘤移植瘤的生长抑制作用

目的:研究腺病毒介导的人ING4基因(Ad-ING4)对MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤的生长抑制作用及其机制。方法:将本室构建好的重组腺病毒表达载体Ad-ING4,经QBI-293A细胞感染多轮扩增后获得高效价重组病毒子以用于肿瘤基因治疗试验,首先建立MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤裸鼠模型,然后将15只荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(PBS组)、空载体对照组(Ad-GFP组)、Ad-ING4实验组(Ad-ING4组),3组均使用瘤体内注射干预用药,隔日一次,共5次。分别于用药前和用药后测量皮下瘤的体积,治疗开始后的第15天将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算抑瘤率。HE染色观察移植瘤细胞形态,免疫组化法检测瘤体中Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34细胞因子的表达。结果:获得了高滴度(109pfu/ml)的重组腺病毒Ad-ING4;经瘤体基因治疗后,Ad-ING4组与PBS组及Ad-GFP组相比,可以明显抑制裸鼠MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤生长,瘤重抑制率可达59.3%,移植瘤组织中可出现典型的细胞凋亡、坏死现象,其分子机制可能与Ad-ING4明显上调瘤体中促进凋亡的细胞因子Bax、Caspase-3的表达,下调抑制凋亡因子Bcl-2及血管形成细胞因子VEGF、CD34的表达有关。结论:Ad-ING4可以显著抑制MG-63人骨肉瘤细胞荷瘤生长,其机制可能通过激活细胞凋亡和抑制血管形成等途径来发挥抑瘤作用。

Ad-ING4-IL-24对骨肉瘤生长抑制效应的实验研究

目的:研究肿瘤生长抑制因子4(ING4)和人白细胞介素24(hIL-24)双基因共表达腺病毒载体对MG-63人骨肉瘤细胞及其裸鼠移植瘤的抑癌增效作用。方法:将Ad-ING4-IL-24腺病毒感染MG-63细胞,用RT-PCR法检测ING4和(或)IL-24基因在肿瘤细胞中的表达。MTT法和流式细胞仪(FCM)检测ING4和(或)IL-24基因的表达对MG-63的生长抑制和促凋亡的影响。用骨肉瘤细胞的裸鼠移植瘤动物模型,检测Ad-ING-IL-24对移植瘤生长的抑制作用,并通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等基因的表达。结果:ING4和IL-24基因在MG-63细胞中成功表达,并对MG-63增殖有明显抑制作用,并能引起细胞凋亡,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高有关。动物实验表明Ad-ING4-IL-24能显著抑制移植瘤生长,瘤重抑瘤率达75.7%。免疫组化结果显示Ad-ING4-IL-24能明显上调Bax、P21和Caspase-3等基因的表达,同时下调Bcl-2和CD34的表达。结论:Ad-ING4-IL-24在肿瘤基因治疗中是非常理想的抑癌增效载体。

Ad-ING4-IRES-IL-24双基因共表达载体的构建及表达

目的:构建IRES介导的携带人肿瘤生长抑制因子4(ING4)和人白介素24(IL-24)双基因的重组腺病毒共表达载体(简称为Ad-ING4-IRES-IL-24),研究其表达产物对A549肺癌细胞生长的影响。方法:将PCR扩增的IRES、ING4和IL-24基因片段分别插入pAdTrack-CMV载体中构建pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24双基因共表达重组转移载体。按腺病毒载体常规构建方法获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24,并在QBI-293A包装细胞中进行包装和病毒扩增。将扩增后的Ad-ING4-IRES-IL-24腺病毒感染A549肺癌细胞,并用RT-PCR和Western blot法鉴定ING4和IL-24基因在QBI-293A细胞或A549肺癌细胞中的表达,MTT法和流式细胞仪检测其对A549肺癌细胞生长抑制和诱导凋亡的功能和抑癌增效作用。结果:DNA测序结果显示pAdTrack-CMV转移载体中插入的ING4、IRES和IL-24片段的序列与GenBank报道的完全一致,Ad-ING4-IRES-IL-24能成功介导ING4和IL-24基因在QBI-293A和A549细胞中表达,不仅能明显抑制A549肺癌细胞生长和诱导其凋亡(72小时生长抑制率为62.82%±0.65%,凋亡率为19.40%±1.29%),而且与Ad-ING4-IRES(72小时生长抑制率为42.31%±0.43%,凋亡率为13.30%±1.85%)和Ad-IRES-IL-24单基因组(72小时生长抑制率为47.44%±0.39%,凋亡率为12.40%±1.05%)相比具有显著性差异(P<0.05)。结论:成功构建了IRES介导的Ad-ING4-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体,Ad-ING4-IL-24不仅能明显抑制A549肺癌细胞生长和诱导其凋亡,而且与Ad-ING4和AdIL-24单基因组相比具有抑癌增效作用。