人IL-17F融合蛋白在E.coli中表达及其生物学活性研究

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F,使其在大肠杆菌中表达,获得GST-hIL-17F融合蛋白,并研究其生物学活性。方法:利用PCR法从自行构建的含hIL-17F基因的pUCm-T/hIL-17F载体中扩增其成熟肽基因序列,亚克隆于pGEX-5X-3中,构建原核表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F,并在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达包涵体融合蛋白,经纯化后进行Westernblot鉴定。MTT法分析GST-hIL-17F纯品蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长抑制作用,ELISA法检测对ECV304内皮细胞表达IL-6、IFN-γ和TNF-α的生物学作用,并采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法分析其对血管形成的影响结果:GST-hIL-17F融合蛋白在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,约占菌体总蛋白的55%,能产生约41kD的融合蛋白,且Westernblot证实确为GST-hIL-17F目的蛋白。GST-hIL-17F具有明显抑制ECV304内皮细胞增殖和上调表达IL-6的生物学效应,并具有显著的抗血管形成活性。结论:hIL-17F重组原核表达和血管形成抑制效应的初步研究已获成功,为进一步研究rhIL-17F的抗血管形成机制和临床应用奠定了基础。

人IL-24基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 :克隆人IL 2 4基因 ,构建真核表达载体 ,在COS 7细胞中进行表达 ,并检测重组表达蛋白hIL 2 4的抗肿瘤活性。方法 :分离人外周血单个核细胞 ,提取细胞总RNA ,采用RT PCR技术克隆人IL 2 4基因 ,将其重组于pUC19,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列 ,构建真核重组表达载体pcDNA3 hIL 2 4 ,进行双酶切和PCR鉴定 ,以质粒pcDNA3 hIL 2 4转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,用RT PCR检测mRNA表达 ,并用MTT法、TUNEL法和流式细胞术检测其诱导肿瘤细胞凋亡的活性。结果 :成功获得 6 2 1bp的人IL 2 4基因 ,测序正确 ,经双酶切和PCR鉴定真核表达质粒构建正确 ,以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR法、MTT法、TUNEL法和流式细胞术检测表明COS 7细胞可表达hIL 2 4 ,且所表达的人IL 2 4具有较强的诱导A5 4 9肺腺癌细胞凋亡的作用。结论 :人IL 2 4基因的瞬时表达和凋亡效应的初步研究已获成功 ,为研究人IL 2

人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应

目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。

应用密度梯度离心法分离扩增兔骨髓基质细胞的体会

目的 探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞 (BMSc)的条件 ,为组织工程学选择合适的种子细胞奠定基础。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离并培养 ,观察其增殖和生长特性 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率。结果 兔BMSc在第 7代前性状稳定 ,生长曲线相似 ;第 4天分裂指数最高为 15 % ;传代后 10h贴壁率高达 90 %。结论 密度梯度离心法是分离兔BMSc的理想方法 ,BMSc能为未来组织工程提供足量种子细胞。

蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞毒性的实验研究

目的研究不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞的毒性及其影响细胞增殖的因素.方法采用组织块培养法体外原代培养鼠胚表皮细胞,用直接接触法和浸提液法体外培养鼠胚表皮细胞,MTT比色法检测其在不同蚕丝蛋白材料上的增殖活力和细胞相对增殖率,进行毒性分析;并用活细胞计数法观察不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞生长的影响.结果鼠胚表皮细胞在1、2、4、5、7、8、10号各型蚕丝蛋白材料上生长,其增殖活力与细胞对照组相当(P＞0.05);在3、6、9号化学交联或HY-823交联型蚕丝蛋白材料上生长,其增殖活力均低于细胞对照组(P＜0.05);而在11号蚕丝蛋白材料其增殖活力显著低于细胞对照组(P＜0.01).1、7号丝胶材料细胞毒性分级为0级(无毒),2、3、4、5、6、8、9、10号各型蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为1级(轻微毒),而11号蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为2级(中度毒).活细胞计数结果与MTT检测结果基本相一致.结论除11号蚕丝蛋白材料外,1～10号各型蚕丝蛋白材料无明显细胞毒性,能支持鼠胚表皮细胞正常生长,具有良好的细胞相容性.

人白细胞介素-24基因的克隆及序列测定

目的 克隆人白细胞介素 - 2 4 (hIL - 2 4 )基因 ,以供重组表达。方法 利用自行设计合成的一对引物 ,采用RT -PCR技术从LPS活化的人外周血单个核细胞的总RNA中分离hIL - 2 4cDNA并重组到 pUC19载体上 ,进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果 PCR及酶切产物电泳结果均证明所克隆的基因为 6 2 1bp。经序列测定证实所克隆的hIL - 2 4与GenBank报道的结果完全一致。结论 该基因系国内首次获得并经序列测定证实的hIL - 2 4cDNA基因。这为进一步在真核或大肠杆菌中高效表达有活性的重组hIL - 2 4 ,更深入地研究其作用机制以及临床应用奠定了坚实的基础。

同种异体血清在体外培养骨髓间充质干细胞的作用研究

[目的]适当的血清浓度可维持骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养,血清浓度过低不利于细胞的生长,而高浓度血清则易引起细胞分化。而血清的不同来源对MSCs的培养同样产生影响。传统的培养方法用胎牛血清作为营养支持,临床应用时存在潜在的风险。本研究探讨同种异体血清在体外培养人骨髓间充质干细胞(hBM-SCs)的可行性。[方法]无菌条件下收集人骨髓悬液,分离hBMSCs,分别用含胎牛血清和人血清的培养基培养。分别测定2种方法培养的hBMSCs细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测分析培养的hBMSCs表面抗原类型;并将培养的hBMSCs诱导分化为软骨细胞及神经细胞,诱导后的软骨细胞及神经细胞采用免疫组化染色分析。[结果]2种方法培养的间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性,表达强度无显著性差异;人血清培养的hBMSCs细胞生长速度快于胎牛血清培养组,但分化效率低于后者。[结论]通过生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,人血清培养hBMSCs与胎牛血清培养差别不大,可以作为一种适合临床的安全培养方法。

再生丝素膜对鼠胚真皮层成纤维细胞生长的影响

目的 研究再生丝素膜对鼠胚真皮层成纤维细胞生长的影响。方法 采用静置贴壁培养法在再生丝素膜上体外培养鼠胚真皮层成纤维细胞 ,并用活细胞计数法及MTT比色法观察再生丝素膜对细胞的形态、功能和生长的影响。结果 再生丝素膜对鼠胚真皮层成纤维细胞的贴壁能力和形态及其代谢功能未见明显改变 ,也未见明显毒性 ,并能支持细胞正常生长 ,呈现正常的生长繁殖曲线。

牛磺酸抑制新生大鼠心肌成纤维细胞胶原合成及其机制的初步研究

目的 研究牛磺酸对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及TGF - β1蛋白表达的影响 ,初步探讨其抗纤维化的作用和机制。方法 在培养的心肌成纤维细胞中加不同浓度的牛磺酸 72h ,用羟脯氨酸法及MTT比色法分别测胶原量和细胞增殖情况 ,ELISA法测TGF - β1蛋白含量。结果 牛磺酸能明显抑制心肌成纤维细胞的增殖及胶原的合成 ,并减少TGF - β1蛋白的表达。结论 牛磺酸能通过下调TGF - β1蛋白的表达 ,抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成 ,起到抗心肌纤维化的作用。

奥沙利铂对A549肺腺癌细胞系生长抑制作用和细胞凋亡的实验研究

目的 观察奥沙利铂对肺腺癌细胞系A5 4 9的药物敏感性和诱导细胞凋亡作用。方法 将不同浓度的奥沙利铂与A5 4 9作用 2 4、36、4 8h ,用MTT法计算细胞生长抑制率 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 奥沙利铂对A5 4 9的细胞生长抑制率随作用浓度和作用时间的增加而增大。 12 .5、2 5、5 0、10 0 μg/ml奥沙利铂对A5 4 9作用 2 4h ,细胞凋亡率分别为 35 %、13.6 %、2 .6 %、1.4 %。结论 奥沙利铂对A5 4 9细胞有生长抑制作用 ,呈剂量依赖性和时间依赖性 ;能引起细胞凋亡 ,细胞凋亡率呈剂量依赖性 ,与细胞生长抑制率呈正相关关系 (P <0 .0 1)。

糖原合成酶激酶-3β参与调控细胞凋亡的机制研究

目的研究糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)参与调控细胞凋亡的作用机制。方法以化疗药物5-FU诱导结直肠癌细胞株colo320凋亡,以无机离子锂抑制GSK-3β活性,用Western Blot检测凋亡细胞总GSK-3β,同时分离细胞核与细胞浆蛋白,分析细胞核/浆GSK-3β水平。结果对照组细胞GSK-3β主要位于胞浆中,凋亡组细胞总的GSK-3β水平没有明显改变,但发生了细胞浆到细胞核的迁移。其选择性活性抑制剂LiCl可抑制5-FU诱导的细胞凋亡,但不能抑制GSK-3β浆/核迁移。结论GSK-3β以细胞浆/核迁移方式参与并促进了5-FU诱导的结直肠癌细胞凋亡,有助于进一步深入了解GSK-3β的生物学特性,在肿瘤研究中,有助于阐明肿瘤发生的机理,为肿瘤的治疗提供了一个新的思路。

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的体外培养和纯化方法,为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs,比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果,根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度,同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞,其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势,三种纯化方法均能使接种14 d后的OECs纯度均值大于75%。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的;在脊髓损伤再生研究中,较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法,差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。

三氧化二砷诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的初步研究

目的 研究三氧化二砷 (As2 O3 )对人喉癌Hep - 2细胞的生物学效应及其作用机制。 方法 Hep - 2细胞经不同浓度的As2 O3 处理 4 8h ,通过MTT法计算细胞生长抑制率 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 As2 O3在 2、1、0 .5、0 .2 5 μmol/L的浓度范围作用Hep - 2细胞 4 8h ,细胞生长抑制率分别为 82 %、6 5 %、33%、15 % ,IC50 为0 .85± 0 .2 5 μmol/L ;细胞凋亡率分别为 2 1.7%、19%、5 .2 %、4 .6 %。 结论 As2 O3 对人喉癌Hep - 2细胞的抑制作用呈剂量依赖性 ,细胞生长抑制率与细胞凋亡率呈正的直线相关关系 (P <0 .0 5 )。

骨髓基质细胞体外成骨能力的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSc)的体外成骨能力,为骨组织工程研究提供细胞来源。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离培养,并观察第2代BMSc在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导条件下的生长及成骨分化情况。结果 BMSc呈成纤维细胞样表现,增殖能力强,在诱导条件下碱性酸酶活性明显增高,并出现矿化结节。结论 BMSc体外增殖能力强,成骨能力肯定。地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠可促进BMSc向成骨细胞分化。

人白细胞介素-17F基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆人白细胞介素-17F基因,并构建含有该目的基因的重组原核表达载体,获得高效表达hIL-17F的基因工程菌。方法利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞的总RNA为模板,扩增出hIL-17F cDNA的编码序列,并分别亚克隆至pUCm-T载体和原核表达载体pGEX-5X-3中,进行PCR、酶切鉴定和DNA序列测定。将重组原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白,且Western印迹鉴定。结果PCR产物大小及其单酶切鉴定均证明所克隆的基因是hIL-17F,DNA序列测定进一步证实与GeneBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F,并在大肠杆菌中获得高效表达,约占菌体总蛋白的55%,且Western印迹证实确为目的蛋白。结论该基因系国内首次克隆,hIL-17F基因重组体的构建和在大肠杆菌BL21中的高效表达,为进一步探讨其生物学活性和应用奠定了基础。

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响

目的观察抗人血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304生物学特性的影响。方法将抗人VEGF发夹状核酶(RZ)基因构建的pcDNA3.1+/RZ转染ECV304细胞,经G418筛选后,用RT-PCR法鉴定RZ基因在ECV304细胞中的转录,用MTT法和流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞增殖活力和细胞周期,ELISA法检测细胞上清VEGF的表达水平。结果RZ基因在ECV304细胞中获得转录,它不改变细胞增殖活力和细胞周期,但能明显下调VEGF的表达。结论抗人VEGF发夹状核酶能够显著抑制ECV304细胞VEGF的表达,为进一步开展核酶的肿瘤基因治疗提供了实验依据。

人重组白细胞介素24和表没食子儿茶素没食子酸酯对肿瘤血管生成的影响

目的观察人重组白细胞介素24(rhIL-24)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对组织新生血管和肿瘤组织血管生成的影响并作比较。方法在鸡胚模型上比较观察rhIL-24、EGCG对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响,在人肺腺癌裸鼠移植瘤模型上比较观察两者对肿瘤组织生长、组织中CD34和NF-κB(p50)的表达影响。结果rhIL-24、EGCG均可抑制CAM上Ⅱ、Ⅲ级血管的生成。rhIL-24组瘤体组织中NF-κB(p50)的表达与PBS组比较有显著性差异,而EGCG组则不明显;rhIL-24组和EGCG组瘤体组织中CD34标记的微血管密度,与PBS组比较均有显著性差异。结论rhIL-24、EGCG都有抑制CAM血管生成和肿瘤组织血管生成的作用,对肿瘤组织中NF-κB表达可能存在不同影响,推测两者或许存在不同的抗肿瘤血管生成机制。

pcDNA3.0/mbcl-2α真核表达载体的构建及其在L929细胞中的表达与实验研究

目的 构建重组真核表达载体pcDNA3.0／mbcl-2α,并在L929细胞中稳定表达,研究mbcl-2α基因表达对L929细胞生物学行为的影响。方法 用PCR法从含mbcl-2α基因的载体pORF-mbcl-2α获得目的基因片段,正向克隆入真核表达质粒pcDNA3.0中。pcDNA3.0／mbcl-2α以脂质体法转染L929细胞,经G418加压筛选,获得阳性单克隆细胞,用RT-PCR检测克隆细胞中mbcl-2α基因的转录,细胞免疫组化染色法检测蛋白表达。台盼兰拒染法进行活细胞计数,判定细胞增殖速率;MTT比色法测定化疗药物阿霉素对细胞生长的抑制率,并分析药物敏感性。结果 构建了重组真核表达载体pcDNA3.0／mbcl-2α,并在L929细胞中稳定表达,获得了可稳定表达mbcl-2α基因的L929细胞株。L929细胞转mbcl-2α基因后,其增殖速率高于对照组,而药物敏感性低于对照组。结论pcDNA3.0／mbcl-2α在L929细胞中可稳定表达,对L929细胞的增殖和药物敏感性均具有一定的影响,为进一步研究mbcl-2α基因的生物学功能奠定了基础。

造血干细胞及相关细胞因子

血液中的血细胞均来自造血干细胞,它独特的生物学特点为许多疾病的治疗开辟了新的途径,HSC的增殖、存活及定向分化受到多种因子的调控。如何在体外通过各种方法大量扩增造血干/祖细胞,又保持其体内造血重建能力显得尤为重要。

重组人IL-18在大肠杆菌中的表达及其抗肿瘤作用

目的:获取rhIL-18原核表达产物并研究其活性。方法:用本室构建的含基因重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌DH5α,经42℃热诱导表达和包涵体提取纯化后获取rhIL-18蛋白;采用ELISA试剂盒检测rhIL-18刺激PBMC分泌IFN-γ的活性及MTT法检测其对NK细胞杀伤K562细胞自然杀伤活性;同时用荷瘤小鼠模型检测其体内抗瘤功能。结果:诱导含重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌DH5α后,蛋白电泳显示出一条相对分子量(Mr)为18 000的蛋白条带;10μgrhIL-18蛋白体外刺激PBMC后,其分泌IFN-γ的能力与对照组相比提高了8倍,细胞毒性提高3倍;同时rhIL-18蛋白能明显抑制肿瘤生长和延长荷瘤鼠生存期。结论:获得了有免疫调节功能和抗肿瘤活性的rhIL-18蛋白,为今后IL-18重组产物的研制和开展肿瘤的生物治疗提供了实验依据。