嵌合体抗原受体修饰的T细胞对CD19^+套式淋巴瘤细胞的杀伤

目的探讨靶向CD19分子的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD19-CAR-T)与未被基因修饰的T细胞相比,是否可以提高对CD19+的套式淋巴瘤细胞的杀伤率。方法通过基因合成和分子克隆手段构建CD19-CAR片段,将CD19-CAR片段克隆到慢病毒载体上,然后用慢病毒对T细胞进行转染。利用PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术检测目的蛋白在T细胞上的表达。最后用流式细胞术检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。结果未被基因修饰的T细胞对CD19阳性的Jeko-1、Rec-1、Maver-1细胞的杀伤效率分别为30%、17%和32%,而CAR-T细胞对上述3种肿瘤细胞的杀伤效率分别为78%、60%和75%。未被基因修饰的T细胞对CD19阴性的293T细胞的杀伤效率为13%,CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效率为24%。结论经CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞可特异性识别CD19分子,对CD19阳性的套式淋巴肿瘤细胞的杀伤效率显著高于未被基因修饰的T细胞,显示出CD19-CAR-T在套式淋巴细胞肿瘤免疫治疗的巨大潜力。

嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤

目的:探讨用特异性靶向HER2抗原的嵌合抗原受体(HER2-CAR)修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率。方法:通过PCR获得HER2-CAR片段,运用常规分子克隆技术,将其构建到慢病毒载体上,利用包装的慢病毒颗粒对NK-92MI细胞进行转染;应用流式细胞术检测细胞转染效率以及转染前后NK-92MI的IFN-γ和颗粒酶分泌差异;使用7-AAD和流式细胞术体外检测HER2-CAR-NK92MI细胞对乳腺癌细胞的杀伤效率;构建小鼠乳腺癌原位肿瘤模型进行体内细胞毒性的检测。结果:用HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌肿瘤细胞MCF-7和T47D的杀伤效率明显高于未被基因修饰的NK-92MI细胞[分别为(62.4±1.3)%vs(22.1±1.2)%和(50.0±1.9)%vs(16.9±0.6)%,P<0.01];而两者对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-468的杀伤效率没有明显差异[(13.6±1.4)%vs(12.7±0.8)%,P>0.05]。同时,经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞相比未被基因修饰的NK-92MI细胞,IFN-γ的分泌明显升高(P<0.01)。结论:经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率明显提高,且具有特异性靶向,此为治疗乳腺癌等恶性肿瘤提供了临床依据。

抗人CD138单克隆抗体以及重组双特异性抗体的开发及应用

目的制备鼠源抗人CD138单克隆抗体,经Western blot验证后,利用其基因序列构建重组抗人CD138抗体以及一种能够同时靶向CD138分子和CD3分子的双特异性抗体并对其功能进行验证。方法通过杂交瘤技术获得鼠源抗人CD138抗体,分子克隆构建重组抗体,Protein A纯化,综合运用Western blot(WB)、Flow cytometry(FC)、ELISA等实验方法进行相关的功能验证。结果鼠源的CD138单克隆抗体特异性强,可用于后续重组抗体的制备,而且重组的抗人CD138单克隆抗体经流式验证,同样可以与表达CD138的肿瘤细胞系(RPMI-8226,U266)进行结合,且不与CD138-的肿瘤细胞系(Jurkat)结合,在此基础上构建的双特异性抗体经功能验证,可以激活T细胞,从而对CD138+的细胞系进行特异杀伤。结论基于鼠源单克隆抗体重组构建表达的双特异性抗体anti-CD138×CD3具有靶向杀伤骨髓瘤细胞的生物活性,为细胞免疫治疗骨髓瘤疾病提供了临床研究基础。

CD19-CAR-T细胞治疗技术的产业化前景

嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞治疗技术自从2010年以来在临床上不断取得突破,特别是靶向CD19分子在针对难治、复发的B细胞来源的血液肿瘤(急、慢性淋巴细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤)的治疗上,获得了传统疗法无法达到的临床疗效,成为当下肿瘤免疫治疗中最为引人关注的领域。不过CAR-T细胞技术在治疗中不断出现的高复发率、毒副作用及CAR-T细胞高昂的制备成本都为这一技术的产业化前景带来了不确定性。本文总结了目前国际上CAR-T细胞治疗技术领军企业的发展现状,就该技术产业化发展面临的挑战进行了深入分析,并展望该产业的发展趋势和产业化前景。

CD28突变的CAR T细胞疗法展现出良好的安全性

为改善CD19靶向的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞治疗后潜在的细胞因子风暴问题,提高临床应用的安全性,将CD28共刺激结构域中的YMNM和PYAP基序双突变,并分别构建包含CD28结构域(19-CD28)和CD28突变结构域(19-CD28M)的CD19-CAR,利用慢病毒载体构建CD19-CAR T细胞和CD19-CAR Jurkat细胞。将CD19-CAR Jurkat细胞株与肿瘤细胞共孵育来验证CD19-CAR对Jurkat细胞的特异性活化效果,随后检测CD19-CAR T细胞与靶细胞共孵育后的细胞毒性和细胞因子释放量。结果显示,与对照组比较,19-CD28-CAR Jurkat细胞和19-CD28M-CAR Jurkat细胞与Raji(CD19~+)细胞共孵育后CD69表达水平上调60%以上,CD25表达水平上调10%左右。在效应细胞∶靶细胞分别为0.5∶1、1∶1、5∶1的条件下,19-CD28-CAR T细胞和19-CD28M-CAR T细胞诱导Raji(CD19~+)细胞的凋亡率比对照组分别增加了15%、25%和40%左右,并于效应细胞∶靶细胞为5∶1时达到饱和。与此同时,19-CD28M-CAR T细胞释放细胞因子Granzyme B、IFN-γ、IL-2、TNF-α的量分别下降了14%、28%、34%和33%。该研究提示,CD28共刺激结构域突变的CD19-CAR T细胞毒性并未减弱,同时安全性显著增强。