抗人CD40单克隆抗体偶联纳米胶束药物载体系统的构建及其生物学特性

目的:将抗人CD40单克隆抗体5C11与3种含有不同反应基团的聚合胶束(polymeric micelle,PM)偶联,构建相应5C11偶联的聚合胶束(5C11 coupled polymeric micelle,PM-5C11),筛选出其中最适合与5C11偶联的PM,并观察该偶联物的生物学特性。方法:分别合成3种不同化学结构的聚合物材料,制备相应PM,与5C11偶联后制备PM-5C11,选择其中偶联率和生物安全性均较高的作为最适PM-5C11。将最适PM-5C11与人Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株作用,观测其生物学活性及其被Daudi细胞摄取的能力。结果:成功制备了分别含对甲苯磺酸酯基、丙烯基、羧基的3种PM,其中含对甲苯磺酸酯基和羧基的PM与5C11的偶联率均明显高于含丙烯基的PM的偶联率[(28.08±2.24)%、(29.06±1.37)%vs(21.26±1.04)%,P<0.05];由于含羧基的PM在制备过程中易残留细胞毒性物质,故选取含对甲苯磺酸酯基的PM作为最适PM。相应的最适PM成功偶联5C11形成PM-5C11,最适PM-5C11显示出5C11原有的生物学活性,并且可被Daudi细胞摄取。结论:构建的3种PM中,含对甲苯磺酸酯基的PM在生物安全性、偶联率及相应PM-5C11的生物学活性方面最优,可作为构建纳米药物载体的最佳选择。

鼠抗人CD28单克隆抗体的制备及体外生物学活性的初步研究

目的:制备纯化的鼠抗人CD28分子的单克隆抗体,初步研究其体外生物学活性。方法:采用诱生腹水法制备抗体,ProteinA免疫亲和层析法进行纯化,并对纯化的抗体进行SEC-HPLC分析测定其纯度;ELISA及流式细胞术检测抗体与重组CD28抗原及Jurkat膜表达CD28的结合活性,表面等离子体共振技术检测抗体与CD28的结合动力学参数,并研究抗体对外周血T细胞增殖的影响。结果:制备获得纯化的鼠抗人CD28分子的单克隆抗体,其纯度>95%,能够结合重组及天然表达的CD28,其半数效应浓度(EC50)分别为19.8μg/ml和15.2μg/ml,该抗体与CD28结合亲和力常数(KD)为2.13×10^-9M。基于细胞的活性分析结果表明,该抗体具有明显的促进人外周血T细胞增殖的活性。结论:本研究制备获得纯化的鼠抗人CD28单克隆抗体,该抗体具有良好的识别CD28的特性以及促进外周血T细胞增殖的活性。

Pristane诱导的系统性红斑狼疮小鼠模型的研究进展

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是由于机体免疫功能紊乱而导致的自身免疫性疾病（[1]）。在SLE患者的体内,细胞异常凋亡,细胞因子分泌失衡,T、B细胞过度活化,产生大量的自身抗体以及造成免疫复合物（Immune complex,IC）沉积,最终累及全身多器官系统造成损害（[2-7]）。虽然确切病因和发病机制仍不明确（[8]）,但一般认为SLE可由多种因素综合作用而诱发,其中环境因素在SLE的发病过程中具有重要的作用。

siRNA沉默抗原递呈细胞表面CD86的表达对T淋巴细胞激活的影响

目的:通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)表面共刺激分子CD86的表达,分析其对T细胞增殖和白介素10及IFNγ-分泌的影响,为移植排异和自身免疫性疾病的治疗提供新的思路和方法。方法:设计并通过化学方法合成三对针对人CD86 mRNA的siRNA片段(siRNA-1、2、3),脂质体法转染人B淋巴瘤Raji细胞;转染24、48、72小时后,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测Raji细胞表面CD86蛋白水平的表达;荧光定量PCR方法检测CD86mRNA水平的表达;分别采用siRNA抑制Raji细胞表面CD86分子的表达、抗人CD86单克隆抗体封闭CD86分子以及二者的联合来阻断CD86-CD28信号通路、MTT和ELISA方法分别检测CD86信号通路被抑制后对T细胞增殖和细胞因子IL-10及IFNγ-分泌的影响。结果:FCM结果显示,Raji细胞表面天然表达CD86的阳性率约为98.0%;转染siRNA后24小时时,仅siRNA-2组表现较为明显的抑制效应,此时细胞表面CD86的阳性表达率约为61.7%,抑制率为37.0%;转染后48小时,control和siRNA-1组Raji细胞表面CD86的表达仍没有变化,而siRNA-2组CD86的表达下降至39.6%,抑制率为59.6%,siRNA-3组CD86的表达下降至72.6%,抑制率为25.9%;siRNA转染后72小时,各组Raji细胞表面CD86的表达均有不同程度的变化,分别为:control组,90.4%;siRNA-1组,83.1%;siRNA-2组,15.2%和siRNA-3组,46.2%;各组的抑制率依次为7.6%,15.2%,84.5%及52.8%。荧光定量PCR结果显示,转染后72小时,仅siRNA-2和siRNA-3组CD86 mRNA水平的表达与Raji细胞相比有显著差异,抑制率分别为78.7%和45.9%。CD86的表达被siRNA-2抑制后,可抑制Raji细胞对T细胞的活化、增殖和IL-10及IFNγ-的分泌;抗人CD86单克隆抗体同样可以抑制Raji细胞对T细胞的激活;并且siRNA-2和抗人CD86单克隆抗体对T细胞的活化抑制具有协同效应。结论:通过siRNA沉默抗原递呈细胞表面共刺激分子CD86的表达,从而阻断CD86/CD28共刺激信号通路,可有效抑制T淋巴细胞的活化、增殖及细胞因子IL-10、IFNγ-的分泌,由此削弱了T细胞应答来诱导免疫耐受。

丁酸钠联合Feed促进293F细胞表达PD-1嵌合抗体

目的:探讨丁酸钠和CHO CD Efficient Feed(以下简称Feed)对293F细胞表达程序性死亡受体-1(PD-1嵌合抗体产量的影响。方法:采用无血清培养基,通过哺乳动物293F细胞瞬时表达抗人PD-1嵌合抗体;在细胞对数生长期添加不同浓度丁酸钠(0,0. 5,1,2,4 mmol/L)处理293F细胞,连续培养7 d,分别在第1,3,5天添加Feed。同时,每24 h对培养细胞进行取样,自动细胞计数仪检测细胞总量和活性,流式细胞术检测细胞周期。结果:丁酸钠联合Feed可有效提高293F细胞表达PD-1嵌合抗体,最高表达量为57.4 mg/L,是对照组产量的近8倍;丁酸钠可抑制细胞过度增殖,并阻滞细胞周期G_1期,同时添加Feed可增加抗体产量。结论:丁酸钠控制293F细胞适度增殖,Feed则有利于提高细胞活力,两者作为细胞培养的有效补充剂可显著提高PD-1嵌合抗体的产量。

抗人B7-1及B7-2双特异性抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人B7-1及B7-2双特异性抗体(anti-B7-1/B7-2-Bs Ab),并分析其与相应抗原结合的特性。方法:采用PCR的方法分别从重组质粒中克隆出抗人B7-1及B7-2单链抗体基因,将其克隆入p IRES2-EGFP表达载体,并用6×His为纯化的标签。用脂质体法将两个基因转染入中华仓鼠卵巢细胞(CHO),经G418加压筛选高表达株,扩大培养并收集上清纯化。分析抗体对膜型B7-1及B7-2的识别及与其相应抗原的结合能力。以天然高表达B7-1及B7-2分子的Raji细胞用丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC为效应细胞,分析抗体通过阻断B7-CD28共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:获得了稳定表达抗人B7-1/B7-2-Bs Ab的CHO细胞株及相应的抗体。该抗体与B7-1及B7-2基因转染细胞株L929-B7-1及L929-B7-2的阳性结合率分别为99.5%及62.0%。Anti-B7-1/B7-2-Bs Ab对抗人B7-1及B7-2单链抗体的竞争结合率分别为0.4%及32.4%。Anti-B7-1/B7-2-Bs Ab通过阻断B7-CD28共刺激信号使PBMC的增殖效应仅为阴性对照组的59.7%。结论:成功构建了稳定分泌抗人B7-1/B7-2-Bs Ab的CHO细胞株(命名为SA-VI)。该抗体可以识别B7-1及B7-2分子并具有良好的生物学活性。

BTLA与HVEM相互作用对T细胞活化的影响

目的:探讨小鼠髓系树突状细胞(BMDC)上HVEM与T细胞上BTLA相互作用对T细胞活化的影响。方法:C57BL/6小鼠的BMDC与T细胞混合培养,HVEM抗体封闭BMDC上的HVEM后,采用MTT法检测T细胞的活化增殖,ELISA试剂盒检测IL-2的分泌。结果:混合培养的启动和早期(0~48 h)、中晚期(48~96 h)以及全程(0~96 h),加入HVEM抗体实验组的T细胞增殖效应均明显高于对照组(P<0.05),同时CD3+T细胞组和CD4+T细胞组IL-2的分泌明显高于对照组(P<0.05)。结论:BTLA-HVEM相互作用产生的负性信号对T细胞的活化起抑制作用,特别是在BMDC与T细胞混合培养的启动和早期(0~48 h),BTLA负性信号就有抑制T细胞活化的作用,有别于传统的负反馈调节抑制,提示T细胞的活化可能存在多种负性调节模式。

CD133^＋肺癌干细胞中基质金属蛋白酶9和缺氧诱导因子2α的表达及其病理学机制

目的 探讨CD133^＋肺癌干细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-9和缺氧诱导因子（HIF）-2α的表达及其病理学机制.方法 选取2009年1至12月苏州大学附属第一人民医院收治的肺癌手术患者组织石蜡标本62例.运用免疫组织化学染色技术检测CD133分子在肺癌组织中的表达,分析其临床意义;实时荧光定量PCR法分析CD133^＋肺癌干细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-9、HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α和MMP组织抑制剂（TIMP）-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4等转移相关基因的表达;分别用乱序siRNA和CD133 siRNA转染肺癌细胞株A549,构建对照-si-A549细胞和CD133-si-A549细胞,PCR法分析两组细胞中CD133、MMP-9和HIF-2α基因的表达;肿瘤侵袭试验分析细胞侵袭迁移能力的改变.结果 51.6％的肺癌组织阳性表达CD133分子,其表达与肺癌的转移和患者生存率密切相关（P＜0.05）.CD133^＋与CD133-细胞中TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、HIF-1α、HIF-1β、MMP-1、MMP-2相对表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05）;CD133^＋细胞中HIF-2α和MMP-9的相对表达量均显著高于CD133-细胞（1.58±0.39比1.10±0.31,1.67±0.38比1.05±0.21,均P＜0.05）.CD 133-si-A549细胞中CD133、HIF-2α和MMP-9相对表达量均显著低于对照-si-A549细胞（0.24±0.10比0.85±0.23、0.19±0.09比0.54±0.18和0.31±0.17比1.12±0.31,均P＜0.05）.CD133-si-A549细胞迁移至下室细胞数量显著低于对照-si-A549细胞（207±25比82±10,P＜0.05）.结论 CD133^＋肺癌干细胞与肿瘤转移和患者预后相关,它可通过上调HIF-2α和MMP-9的表达促进肿瘤的转移.

转录因子Eomes调控CD8^(+)T细胞效应功能、免疫记忆和耗竭

脱中胚蛋白(Eomesodermin, Eomes)是与CD8^(+)T细胞分化和效应功能密切相关的T-box家族转录因子。在应对慢性病毒感染及抗肿瘤免疫应答的过程中,Eomes可促进初始CD8^(+)T细胞分化为效应CD8^(+)T细胞并增强其效应功能,驱动经典记忆T细胞的形成和维持,并且与CD8^(+)T细胞的耗竭密切相关。文章就Eomes在调控CD8^(+)T细胞效应功能,免疫记忆和耗竭方面的作用及潜在机制展开探讨,以发掘抗肿瘤免疫治疗的新策略。

B7-H3和Toll样受体4分子在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨B7-H3和Toll样受体4（TLR4）分子在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法收集142例结直肠癌患者的肿瘤组织及临床资料，免疫组织化学方法检测B7-H3和TLR4分子在肿瘤组织中的表达，并对结果进行统计学分析。结果肠癌组织中B7-H3分子的表达与淋巴结转移和远处转移明显相关（P〈0．05），TLR4分子的表达与淋巴结转移明显相关（P〈0．05）。B7-H3和TLR4分子的表达有相关（P〈0．05）。B7-H3与TLR4共同高表达44例，B7-H3高表达而TLR4低表达者23例，B7-H3低表达而TLR4高表达36例，共同低表达39例。生存分析结果显示肿瘤组织中B7-H3或TLR4分子表达水平低的患者其生存率显著高于表达水平高的患者（P〈0．05）。结论B7-H3和TLR4的表达水平与结直肠癌临床特征相关，可能参与了结直肠癌的免疫病理过程。

协同刺激分子B7-H1和B7-H3在乳腺癌的表达及临床意义

目的研究协同刺激分子B7同源体1(B7-H1)和B7-H3在乳腺癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测59例乳腺癌组织及其相应癌旁正常组织中B7-H1、B7-H3表达,并分析其与临床特征的相关性。结果乳腺癌组织中B7-H1和B7-H3阳性表达率分别为47.46%和57.63%,均高于癌旁正常组织(P<0.05)。B7-H1表达与B7-H3表达呈正相关(r=0.917,P<0.01)。乳腺癌组织中B7-H1表达与人类表皮生长因子受体2(Her-2/neu)表达相关(P<0.05),与患者预后无明显相关(P>0.05);而B7-H3表达与患者肿瘤分期及预后均密切相关(P<0.05)。B7-H1/B7-H3双阳性患者5年中位生存率小于B7-H1/B7-H3双阴性患者(61.80%vs.90.10%)(P<0.05)。结论 B7-H1和B7-H3过表达在乳腺癌进展中发挥重要作用,对乳腺癌诊断及预后判断可能具有重要价值。