TNF-α抑制多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞成骨潜能

目的探讨多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨潜能变化,以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)对MSCs成骨潜能的影响。方法分离培养MM患者和正常人的MSCs,鉴定其生物学特性。体外成骨诱导后,实时RT-PCR检测其成骨指标的变化,VonKossa染色测定其钙质沉积,ELISA法检测MM患者和正常人骨髓血清中TNF-α的浓度。MSCs成骨体系中加入TNF-α,2周后检测MSCs成骨指标mRNA表达量及其钙质沉积程度。结果MM患者的MSCs成骨潜能较正常人降低,其骨髓血清中的TNF-α浓度较正常人高。TNF-α可以抑制MSCs成骨潜能。结论TNF-α抑制MSCs成骨潜能可能参与骨髓瘤骨病发病机制。

候选抑癌基因ING4的研究进展

ING4基因是近年来发现的一个ING(生长抑制因子家族)新成员,可能通过抑制细胞生长,增强其化学敏感性、增强P53的活性、抑制HIF活性、抑制肿瘤血管增生等途径抑制肿瘤的生长。ING4基因在正常组织中表达丰富,而在肿瘤组织中表达异常与发生突变,但其在肿瘤发生、发展过程中的确切作用尚不清楚。

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165），并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板，PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165，行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165），再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞，通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒，并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒，其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后，QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较，CAM三级分支血管生长更旺盛，毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体，具有明显的促CAM血管形成活性，为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。

Ad-hING4联合^(125)Ⅰ粒子对裸鼠胰腺癌移植瘤的抑癌增效作用

本工作探讨腺病毒介导的人ING4基因(Ad-hING4)联合125I粒子对裸鼠胰腺癌移植瘤的抑癌增效作用及其可能的机制。将本室构建的Ad-hING4腺病毒感染QBI-293A细胞,扩增后获得高滴度的病毒。建立25只裸鼠胰腺癌PANC-1皮下移植瘤模型,分成PBS对照组、空病毒Ad组、125I粒子近距离放疗组、Ad-hING4基因治疗组、125I粒子和Ad-hING4联合治疗组,进行抑瘤治疗实验;此后每5天测量1次肿瘤体积,20天后处死,计算抑瘤率和金氏q值。常规病理切片观察细胞生长形态、组织损伤程度和范围,并进行凋亡细胞计数(AI);免疫组化SP法检测肿瘤标本中微血管密度(MVD)、生存素Survivin和活化的Caspase-3凋亡相关蛋白的表达。结果发现,125I粒子组、Ad-hING4组、联合治疗组抑瘤率分别达到34.19%(P<0.01)、31.50%(P<0.01)、67.15%(P<0.01),联合治疗组抑瘤率明显高于125I粒子和Ad-hING4治疗组(P<0.01);病理切片检查显示近粒子处肿瘤细胞变性坏死,远离粒子处可见存活肿瘤细胞;三个治疗组凋亡指数(AI)、Caspase-3阳性细胞数明显高于PBS组(P<0.05),且联合治疗组明显高于125I粒子和Ad-hING4治疗组(P<0.01);三个治疗组MVD值、Survivin阳性细胞明显低于PBS组(P<0.05),且联合治疗组明显低于125I粒子和Ad-hING4治疗组(P<0.01);Ad组与PBS组的各指标无显著性差异(P>0.05)。可见125I粒子、Ad-hING4可显著抑制裸鼠PANC-1胰腺癌移植瘤的生长,两者联用具有抑癌增效的协同作用,Ad-hING4有望作为一种新的放疗增敏剂;其抑瘤机制可能是通过下调Survivin和上调Caspase3的表达,以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成。

多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞免疫调节功能异常及其在骨髓瘤骨病中的作用

目的 探讨多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓间充质干细胞（MSCs）免疫调节功能及其对骨髓瘤骨病的影响.方法 分离MM患者和正常对照MSCs,流式细胞技术比较二者的免疫表型.Real-time PCR检测实验组及对照组MSCs的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-6、IL-3、TNF-α、FasL和NF-κB配体的受体激活物（RANKL）表达量.共培养系统与流式细胞术检测MSCs对T细胞增殖、凋亡和早期活化标志CD25和CD69表达的影响.Von kossa染色、real-time PCR和Western blot等技术检测T细胞对正常对照MSCs向成骨细胞分化的影响.结果 MM来源和正常对照MSCs具有相似的形态学和免疫表型.MM来源的MSCs表达TGF-β1、IL-6、IL-3、TNF-α和RANKL较正常对照MSCs增加,而TGF-β2、TGF-β3和FasL的表达下降.MM来源的MSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱.正常对照MSCs较MM来源MSCs使更多T细胞静止于G0/G1期.正常对照MSCs明显促进T细胞凋亡,而MM来源的MSCs对T细胞的促凋亡作用减弱.正常对照MSCs明显抑制T细胞活化分子表达,而MM患者的MSCs此抑制作用明显降低.与MM患者的MSCs共培养后的T细胞以及直接来源于MM患者的T细胞均可以明显抑制正常对照MSCs向成骨细胞分化.结论 MM患者的MSCs免疫调节功能较正常对照MSCs降低,主要表现为抑制T细胞活化的功能减弱,而活化的T细胞可抑制MSCs向成骨细胞分化,此可能为骨髓瘤骨病发病机制之一.

抑制缺氧诱导因子-1α仪表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞裸鼠体内成瘤性的影响

目的利用RNA干扰（RNAi）技术抑制多发性骨髓瘤（MM）细胞系RPMI8226细胞中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）表达，探讨对RPMI8226细胞在裸鼠体内成瘤性的影响。方法利用短发夹RNA（shRNA）表达载体pSilencer2．1-U6 hygro构建RNAi载体，在RPMI8226细胞中抑制HIF-1α的表达。应用RT—PCR技术和Western blot方法，鉴定RNAi后HIF-1α的表达。ELISA法测定细胞上清中血管内皮生长因子（VEGF）表达的改变。流式细胞术检测RNAi前后细胞周期的改变。研究缺氧（PO2 为1％）条件下，抑制HIF-1α的表达对其靶基因VEGF和葡萄糖转运蛋白（Glut-1）表达的影响。利用异种移植瘤模型观察HIF-1α干扰后对肿瘤生长的影响。结果RNAi后，HIF-1α的表达在mRNA和蛋白水平均明显降低。常氧条件下，RNAi组（RPMI8226-i1和RPMI8226-i2）和未干扰组（RPMI8226-c和RPMI8226）细胞上清中VEGF浓度无明显差异；缺氧条件下四组细胞上清中VEGF浓度分别为（506．0±53．2）、（494．7±63．1）、（984．4±61．9）和（938．2±62．2）pg／ml。RPMI8226-i1和RPMI8226-i2组较RPMI8226-c和RPMI8226组明显降低（P〈0．05）。G0／G1期累积受到抑制，S期细胞比例增加。缺氧条件下VEGF和Glut-1等靶基因的表达明显下调（P〈0．05）。裸鼠皮下成瘤性实验表明，抑制HIF-1α的表达，能够明显抑制肿瘤的生长。结论RNAi抑制RPMI8226细胞HIF-1α表达，可能通过抑制肿瘤的血管新生和糖代谢过程来发挥肿瘤抑制作用。