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人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达 被引量:6
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作者 刘铁连 谢宇锋 +5 位作者 盛伟华 缪竞成 单云波 胡志清 井莹莹 杨吉成 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第41期8103-8106,共4页
目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP... 目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0~5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。 展开更多
关键词 血管生成素1 血管内皮生长因子 腺病毒载体 构建
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血管生成素1基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用
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作者 孙凌 谢宇锋 +4 位作者 杨吉成 杨向军 盛伟华 贾红亮 吕海涛 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2011年第4期334-337,共4页
目的 构建携带人血管生成素1(Ang-1)基因的腺病毒表达载体,并观察其感染QBI-293A靶细胞后目的基因的表达及其促血管新生的效应。方法 以骨髓细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增Ang-1基因片段,于BglⅡ、Sal Ⅰ酶切位点亚克隆至pAdTrack-CM... 目的 构建携带人血管生成素1(Ang-1)基因的腺病毒表达载体,并观察其感染QBI-293A靶细胞后目的基因的表达及其促血管新生的效应。方法 以骨髓细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增Ang-1基因片段,于BglⅡ、Sal Ⅰ酶切位点亚克隆至pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒。然后pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒同源重组后,再经QBI-293A细胞包装、扩增和纯化获得高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒。RT-PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性Ang-1基因在QBI-293A细胞中的转录和表达。将鸡胚随机分成3组:Ad-Ang-1重组腺病毒组、Ad空载体腺病毒组、生理盐水(NS)组,观察鸡胚绒毛膜尿囊膜(CAM)新生血管形成。结果获得了高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒,其病毒效价可达3×1010 pfu/ml。Ad-Ang-1感染后,QBI-293A细胞中的Ang-1含量(47522.53±3685.57) ng/L较QBI-293A细胞对照组(2490.86±550.95) ng/L和Ad空病毒感染组(2323.20±260.55) ng/L均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。Ad-Ang-1重组腺病毒组有效地促进了二、三级分支血管的生成。结论 成功获得了携带人Ang-1基因的腺病毒表达载体,为进一步开展Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。 展开更多
关键词 血管生成素1 腺病毒 基因载体 构建 血管形成
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