EGFR与肿瘤细胞放射敏感性

表皮生长因子(Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)属于酪氨酸激酶受体,在多种上皮来源的恶性肿瘤中存在着过度表达和变异。EGFR与相应配体结合后激活,继而活化一系列下游信号通路并产生众多的生物效应。EGFR信号通路与肿瘤细胞放射敏感性降低密切相关,其机制可能与促进细胞增殖、抑制凋亡、调控细胞周期阻滞、促进DNA辐射损伤修复有关,运用EGFR单克隆抗体和小分子特异性抑制剂可以增强肿瘤细胞的放射敏感性。

沉默生存素基因增强人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性

为探讨沉默生存素(Survivin)基因对人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响,利用靶向Survivin基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)质粒pGenesil-survivin,采用阳离子脂质体介导法转染SMMC-7721细胞后48 h,分别以RT-PCR和Western blot法检测Survivin基因mRNA和蛋白表达,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果表明,转染质粒pGenesil-survivin后48 h,SMMC-7721细胞Survivin基因mRNA和蛋白表达水平与对照和阴性干扰组相比明显降低(p<0.05);转染后第1—4 d,细胞增殖活性与对照组相比明显降低(p<0.05或p<0.01);转染后48 h,细胞阻滞于G2/M期(p<0.001),凋亡百分率明显高于对照组(p<0.001);转染后SMMC-7721细胞D0值减小,放射敏感性增强,增敏比为1.24。结果提示,沉默生存素基因可增强人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性。

肿瘤放射增敏是当今放射医学的研究热点

放射医学是研究电离辐射损伤机制、诊断、治疗和防护的一门综合性交叉学科。放射生物学主要研究辐射损伤响应过程和生物学后果的分子事件和调控机制,是放射医学的基础和前沿。随着微束照射、基因组学与蛋白质组学和生物信息、干细胞技术以及活细胞分子影像和实时动态成像等新技术的应用,

用HPRT基因突变及CBMN研究AT细胞高辐射敏感性

研究了毛细血管扩张性共济失调症(Ataxia?telangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT5BIVA(AT细胞)的高辐射敏感性。以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM0639(GM细胞)为对照,利用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Hypoxanthinephospho?ribosyltransferase,hprt)位点突变分析技术及胞质分裂阻滞微核法(Cytokinesis?Blockmicronucleusmethod,CBMN),在AT细胞和GM细胞经Coγ射线0、1、2、3、4Gy60照射后,观察比较AT细胞和GM细胞之间hprt基因位点突变频率(hprtMF)、微核率(MNF)及微核细胞率(MNCF)的差异,并分别进行曲线拟合。在各剂量点,AT细胞hprt基因突变频率、微核率及微核细胞率均明显高于GM细胞,其差别具有显著性统计意义(p<0.01);AT和GM细胞hprt基因突变频率、微核率及微核细胞率均与照射剂量呈正相关,可拟合成剂量效应直线方程y=a+bx。结果表明,毛细血管扩张性共济失调症患者AT细胞辐射敏感性显著高于GM细胞,具有高辐射敏感性。

ATM与辐射激活的磷酸化P53、P21蛋白的相互作用

背景与目的:ATM基因属于PI-3K激酶家族成员,其编码蛋白具有调控DNA修复过程和调整细胞周期关卡的功能。毛细血管扩张性共济失调症(ataxia-telangiectasia,AT)患者AT细胞中ATM基因的突变导致了辐射诱发的P53、P21磷酸化缺失,说明辐射激活ATM基因可调控P53、P21的磷酸化。本实验利用免疫共沉淀及Westernblot技术来研究辐射激活的ATM基因与p53的关系,并观察ATM基因是否不通过P53而直接调控P21的磷酸化。方法:利用电穿孔技术将含有ATM基因cDNA的真核表达载体pEBS7-YZ5转染到AT细胞中,用潮霉素筛选以获得稳定表达细胞株,RT-PCR检测ATMcDNA的转录以进一步验证;在ATM稳定表达的AT细胞中,利用免疫共沉淀及Westernblot技术研究ATM基因与p53基因的相互关系;以K562细胞(p53突变)为p53突变细胞模型,研究ATM是否直接磷酸化P21。结果:pEBS7-YZ5成功转进AT细胞,RT-PCR检测到ATMcDNA片段;ATM稳定表达的AT细胞株在电离辐射诱导下,P53被磷酸化,免疫共沉淀显示ATM与P53相互作用;K562细胞经60Coγ射线照射后,P21被磷酸化,ATM抗体免疫共沉淀物中检测到P21蛋白的存在。结论:细胞遭受电离辐射作用后所激活的ATM激酶,可通过磷酸化P53继而活化细胞周期检控点P21蛋白,也可在电离辐射导致DNA损伤早期直接磷酸化P21蛋白,来启动DNA修复机制。

沉默乏氧诱导因子-1α和生存素基因联合放疗对裸鼠移植人肝癌的抑瘤效应

为探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)乏氧诱导因子-1α(Hypoxia induced factor1α,HIF-1α)和生存素(Survivin)基因联合X射线照射对裸鼠移植人肝癌细胞SMMC-7721的抑瘤效应,肿瘤局部注射脂质体包裹的靶向HIF-1α和/或Survivin基因的RNA干扰质粒后,接受5Gy X射线照射。观察各组裸鼠治疗后不同时间肿瘤体积和平均存活时间,以免疫组化染色法检测肿瘤组织Survivin、HIF-1α、增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)表达和肿瘤间质微血管密度,以TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。结果表明,治疗开始后第9-21天,双干扰联合放疗组裸鼠肿瘤体积显著小于单干扰联合放疗组,且平均生存时间明显延长。治疗结束后1天,双干扰联合放疗组裸鼠肿瘤组织Survivin、HIF-1α、PCNA表达和肿瘤间质微血管密度明显低于对照组和放疗组,双干扰联合放疗组移植瘤凋亡细胞百分数较其它组明显升高。结果提示,双干扰联合放疗可有效地抑制裸鼠移植人肝癌细胞增殖和血管生成,促进细胞凋亡,其抑瘤效应明显优于放疗和单干扰联合放疗。

青蒿素对人宫颈癌细胞的毒性和放射增敏研究

目的探讨青蒿素对宫颈癌细胞系HeLa的毒性和放射增敏作用。方法采用MTT法检测青蒿素对HeLa细胞的毒性,测出青蒿素的最适作用浓度和作用时间。用MTT法检测青蒿素对HeLa细胞放射增敏的影响,用多靶单击方程拟合HeLa细胞的剂量存活曲线求出辐射增敏比,评价增敏效果。用流式细胞仪检测细胞周期。结果青蒿素与HeLa细胞作用24h的IC50为600.19nmol/ml,作用48h的IC50为160.71nmol/ml。青蒿素对HeLa细胞的辐射增敏比(SER)为1.17。单放组和增敏组放疗后24h的周期变化,不同照射剂量的增敏组G2/M期比例下降。结论青蒿素对宫颈癌细胞系HeLa有毒性作用,且有剂量依赖性和时间依赖性。青蒿素对HeLa细胞有放射增敏性,青蒿素能抑制电离辐射诱导的G2期阻滞。

胞质分裂阻滞微核法对AT细胞高辐射敏感性的研究

目的 研究源于毛细血管扩张性共济失调症 (ataxia telangiectasia ,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT5BIVA(AT细胞 )的辐射敏感性。方法 本实验以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM0 63 9(GM细胞 )为对照 ,采用胞质分裂阻滞微核法 (Cytokinesis Blockmicronucleusmethod) ,在AT细胞和GM细胞经60 Coγ射线 0、1、2、3、4Gy照射后 ,观察比较AT细胞和GM细胞之间微核率及微核细胞率的差异 ,并分别进行曲线拟合。结果 在 1、2、3、4Gy剂量照射下 ,AT细胞微核率及微核细胞率均明显高于GM细胞 ,其差异有非常显著性 (P <0 0 1) ,并且两者微核率及微核细胞率均与剂量呈正相关 ,均可拟合成剂量效应直线方程y =a +bx ,微核率及微核细胞率直线回归方程斜率AT细胞明显大于GM细胞 (P <0 0 1)。结论 辐射敏感性AT细胞显著高于GM细胞 ,AT患者AT细胞具有高辐射敏感性。

沉默乏氧诱导因子-1α和生存素基因联合X射线照射对乏氧细胞的体外抑瘤效应

为探讨RNA干扰(RNAinterference,RNAi)沉默乏氧诱导因子-1α(Hypoxia induced factor 1α,HIF-1α)和生存素(Survivin)基因联合X射线照射对乏氧人肝癌细胞SMMC-7721的体外抑瘤效应,利用双靶向HIF-1α和Survivin基因载体,采用阳离子脂质体介导法转染SMMC-7721细胞,经乏氧培养36h后,分别以RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α和Survivin基因的mRNA及其蛋白表达,分别以四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术检测细胞存活分数及细胞凋亡。结果表明,转染质粒pGenesil-Survivin-HIF的SMMC-7721细胞中,HIF-1α和Survivin基因mRNA表达水平与对照和阴性干扰组相比明显降低(p<0.05),也未检测到HIF-1α和Survivin蛋白的表达。单、双干扰联合放疗组存活分数较照射组明显降低(p<0.01),双干扰联合放疗组存活分数较其它组也明显降低(p<0.01)。单、双干扰联合放疗组凋亡细胞百分数较对照组明显升高(p<0.01),双干扰联合放疗组凋亡细胞百分数较其它组也明显升高(p<0.01)。结果提示,质粒pGenesil-Survivin-HIF可有效地干扰乏氧SMMC-7721细胞HIF-1α和Survivin基因的mRNA及其蛋白表达。双干扰联合放疗组对乏氧SMMC-7721细胞的体外抑瘤效应明显优于单干扰联合放疗组。

pshuttle-Egr1-Smac质粒对MCF-7细胞的辐射致敏作用及细胞周期进程的影响

目的研究含辐射敏感Egr-1启动子介导Smac基因的重组质粒pshuttle-Egr1-hSmac对辐射人乳腺癌MCF-7细胞的致敏作用及细胞周期进程的影响。方法将其质粒经脂质体转染到MCF-7细胞中,24 h后利用克隆形成法计算存活分数,评价细胞的辐射敏感性;利用流式细胞术检测X射线照射后细胞周期进程的变化。结果 MCF-7细胞转染质粒24 h后,经0、2、4、6、8和10 Gy X射线照射后14 d,对照和pshuttle组细胞存活分数基本一致,而转染质粒的细胞存活分数明显低于对照组(P<0.05,P<0.01);通过相关与回归分析,对照和pshuttle组细胞D0值分别为3.27和3.28,而转染质粒的D0值为2.1。pshuttle组各期细胞百分数变化不明显;而转染质粒的G0/G1期细胞百分数明显高于对照和pshuttle组,S期细胞明显降低(P<0.01,P<0.001);2 Gy照射后24 h各组G0/G1期细胞百分数增加,S期细胞降低,其中以转染质粒的细胞变化最明显(P<0.05,P<0.01)。结论 pshuttle-Egr1-hSmac质粒能够增强人乳腺癌MCF-7细胞的辐射敏感性,可致细胞G1期阻滞,暗示Smac基因对乳腺癌的放疗具有辐射增敏作用。

靶向乏氧诱导因子-1α和生存素基因的RNA干扰腺病毒穿梭载体的构建

目的构建能同时干扰乏氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor1α,HIF-1α)和生存素(survivin)基因表达的RNA干扰(RNA interference,RNAi)腺病毒穿梭载体,并检测其对人肝癌SMMC-7721细胞HIF-1α基因和生存素基因表达的干扰作用。方法根据GeneBank数据库中HIF-1α和生存素基因的cD-NA序列设计干扰序列,构建干扰HIF-1α和生存素基因的重组单基因干扰质粒pGenesil-HIF-1α和pGene-sil-survivin。酶切、测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染SMMC-7721细胞,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HIF-1α和生存素基因的mRNA表达水平。将两个单基因干扰质粒的干扰序列和U6启动子序列切下并连入腺病毒穿梭载体pshuttle,构建双基因干扰载体pshuttle-Genesil-survivin-HIF-1α,并检测其对HIF-1α和生存素基因mRNA表达的干扰作用。结果测序和酶切鉴定结果显示,pGenesil-HIF-1α和pGenesil-survivin重组质粒构建正确。SMMC-7721细胞分别被pGenesil-HIF-1α和pGenesil-survivin转染48h后,HIF-1α和生存素基因mRNA水平与正常和阴性对照组相比明显降低。双基因干扰载体pshut-tle-Genesil-survivin-HIF-1α酶切鉴定所得片段大小与预期相符,转染该质粒48h后,SMMC-7721细胞中HIF-1α和生存素基因mRNA的表达明显降低。结论成功构建能同时干扰HIF-1α和生存素基因的腺病毒穿梭载体,可有效地同时抑制SMMC-7721细胞内HIF-1α和生存素基因mRNA的表达。

外源性ATM基因对辐射诱导AT细胞端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

通过观察外源性毛细血管扩张性共济失调症突变基因(Ataxia-telangiectasiamutation,ATM)对毛细血管扩张性共济失调症(Ataxia-telangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT5BIVA(AT细胞)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)mRNA表达的影响,探讨ATM对hTERT的调控作用。采用RT-PCR法,对比ATM基因转染前、后AT细胞hTERTmRNA表达的变化及与源自正常人皮肤的成纤维细胞系GM0639(GM细胞)相比的差异;以及细胞经3Gy60Coγ射线照射后其hTERTmRNA表达的变化。结果显示,未照射时,GM细胞hTERTmRNA表达呈阴性,AT细胞hTERTmRNA表达呈阳性,转染ATM基因后的ATM+-AT细胞其hTERTmRNA的表达明显下降(p<0.05);60Coγ射线照射后,GM细胞hTERTmRNA表达呈阳性,AT细胞、空载体AT细胞(PEBS7-AT细胞)和ATM+-AT细胞hTERTmRNA的表达量比未照射时明显增加(p<0.05),ATM+-AT细胞hTERTmRNA相对表达量的增加低于AT细胞和空载体AT细胞(p<0.05)。提示ATM可下调hTERTmRNA的表达;电离辐射可诱导细胞hTERTmRNA表达;端粒酶参与DNA损伤修复。

^(60)Coγ射线照射对AT细胞周期进程的影响

目的 研究AT细胞辐射高敏感性与细胞周期进程间的联系。方法 用细胞流式术检测2 Gy60Coγ射线照射后不同时间及不同剂量照射后GM0639和AT5BIVA两种细胞的细胞周期分布状况。结果 GM0639细胞受2 Gy60Coγ射线照射后,从照射后即刻至第24小时,G2／M细胞比例逐步增大,出现了G2阻滞,0~6 Gy60Coγ射线照射24 h后,G2／M细胞比例随剂量增大而增大;AT5BIVA受2 Gy60Coγ射线照射后不同时间及0-6 Gy60Coγ射线照射24 h后,G2／M细胞比例减小,不发生G2阻滞。结论 ATM基因突变所导致的细胞周期关卡丧失及DNA修复能力降低是AT细胞辐射高敏感性的重要原因。

常规染色体畸变分析法对AT细胞高辐射敏感性的研究

目的 研究毛细血管扩张性共济失调症(ataxia-telangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT5BIVA(AT细胞)的高辐射敏感性。方法 以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM0639(GM细胞)为对照,用常规染色体畸变分析法,在AT细胞和GM细咆经60COγ射线0、1、2、3、4 Gy照射后,观察比较AT细胞和GM细胞之间染色体畸变率(CAF)的差异,并分别进行曲线拟合。结果 在0、1、2、3、4 Gy剂量下,AT细胞染色体畸变率明显高于GM细胞(P<0.05);AT和GM细胞染色体畸变率与剂量成正相关,均可拟合成剂量效应直线方程Y=a+bX,且AT细胞剂量效应直线回归方程斜率明显大于GM细胞(P<0.05)。结论 AT患者AT细胞的辐射敏感性显著高于GM细胞,具有高辐射敏感性。

免疫共沉淀探讨septin蛋白家族间的相互作用

目的 :探讨人肝癌中表达的 3种septin蛋白 1 ,2和6自身之间和相互之间是否存在相互作用关系 ,从而探讨在肝癌中septin家族的作用方式 .方法 :通过构建septin家族基因的pCMV Myc ,pCMV HA表达载体 ,采用人肾 2 93细胞内蛋白的免疫共沉淀进行验证蛋白的相互作用 .结果 :Septin家族蛋白中确实存在着相互作用 ,不仅蛋白相互之间存在相互作用 ,且同一种蛋白质的分子之间也存在着较强的相互作用 .结论

乏氧调控因子miR-210的研究进展

乏氧是实体肿瘤发展过程中的普遍现象,肿瘤乏氧细胞的存在使肿瘤对放化疗的抗性增加,更容易侵袭和转移。乏氧诱导因子(hypoxia-induciblefactors,HIF)调控能量代谢、细胞周期进程和凋亡等相关基因表达使细胞更加适应缺氧微环境,在相关酶或因子的变化过程中起中枢纽带作用。miR-210也参与调控乏氧细胞的生物学功能,在乏氧条件下的表达变化显著,无细胞特异性,已被证实在不同种类的乏氧肿瘤细胞和正常细胞中均以依赖HIF-1的方式表达上调。

ATM对辐射后AT细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨ATM对电离辐射照射的毛细血管扩张共济失调症(ataxia telangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT细胞(ATSBIVA)端粒酶活性的影响。方法:以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(GM0639)为对照,应用基于PCR的端粒重复扩增技术(telomeric repeat amplification protocal,TRAP)与高效液相色谱(HPLC)技术,定量分析细胞分别经0、1、3、5 Gy 60Coγ射线照射后以及经3 Gy 60Coγ射线照射后继续培养2、24、48、72 h,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性的变化。结果:未照射时,除GM细胞外,AT、空载体AT、ATM+-AT细胞均呈现较高的端粒酶活性表达,但ATM+-AT细胞的端粒酶活性明显低于AT和空载体AT细胞的端粒酶活性(P<0．01),而后二者无明显差异(P> 0．05);电离辐射照射后,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性均呈剂量依赖性和时间依赖性增强,且在相同剂量点与时间点,ATM+-AT细胞的端粒酶活性高于GM细胞(P<0．01)(除5 Gy计量点外),但低于AT和空载体AT细胞(P<0．01),而后二者无明显差异(P>0．05)。结论:电离辐射可诱导细胞端粒酶活性表达;并且细胞端粒酶活性水平随剂量与时间的增加而增加;ATM可下调AT细胞端粒酶活性水平。推测端粒酶参与电离辐射诱导DNA损伤的修复。

低水平超氧阴离子对人胃粘膜上皮细胞系(GES-1)促增殖作用的研究

目的 探讨GES 1细胞体外培养的增殖及O2 ·的生成情况及PMA、DPI、SOD对GES 1生成O2 ·和GES 1增殖的影响。方法 体外培养GES 1细胞分别为 2 4、4 8、72h ,3 H Tdr掺入法测定GES 1细胞CPM值 ,了解GES 1细胞增殖情况。细胞色素C还原法测定GES 1细胞产生O2 · 水平 ,并观察PMA、DPI对GES 1生成O2 ·和GES 1增殖的影响 ,不同浓度SOD对GES 1增殖的影响。结果 GES 1细胞能够自身产生O2 ·,PMA增加GES 1细胞产生O2 ·,可以促进GES 1细胞的增殖。DPI和SOD减少GES 1细胞产生O2 ·,可以抑制GES 1细胞的增殖。结论 低水平增加O2 ·可以促进GES 1细胞的增殖。提示氧化 抗氧化作用可能在胃相关疾病的防治中具有一定的意义。

白细胞介素1β对人胃粘膜正常上皮细胞增殖的影响

目的研究白细胞介素1β(IL-1β)对人胃粘膜正常上皮细胞(GES-1)株增殖的影响。方法用IL-1β与GES-1细胞培养,用3H-Tdr掺入法测定及MTT比色法分析检测总活细胞数来估计GES-1细胞DNA合成及细胞生成情况。结果IL-1β以剂量依赖性增加GES-1细胞DNA合成及细胞数量。IL-1β对GES-1细胞的增殖作用可被IL-1ra阻断,IL-1β抗体对此无抑制作用。结论IL-1β刺激可引起GES-1细胞的增殖。IL-1β是GES-1细胞的生长因子,在调节GES-1细胞增殖中有重要作用。IL-1β涉及幽门螺杆菌感染胃粘膜细胞的高增殖反应和胃癌的致癌过程。

WORT对血清饥饿及辐射诱导血清饥饿的SHG44增殖抑制作用的影响

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶的相对特异性抑制剂WORT(Wortmannin,渥漫青霉素)对血清饥饿的SHG44细胞及辐射诱导血清饥饿的SHG44增殖抑制作用的影响。方法用甲基噻唑基四氮唑盐(Methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法测定不同浓度的WORT处理的血清饥饿及血清饥饿后5 Gy照射的SHG44细胞的存活率。结果血清饥饿后,1.00×10-8mol/L^5.00×10-7mol/L的WORT使细胞存活率随WORT浓度的升高而降低(P<0.05),5.00×10-7mol/L^5.00×10-6mol/L的WORT使细胞存活率的降低出现平台期,1.50×10-5~3.00×10-5mol/L范围内细胞存活率再一次出现下降(P<0.05)。实验结果表明WORT可使血清饥饿后再接受5 Gy照射的细胞存活率进一步降低(P<0.05)。结论血清饥饿后,渥漫青霉素可抑制SHG44细胞的增殖,并提高辐射诱导血清饥饿细胞的增殖抑制作用,其机制可能与抑制PI3K通路以及PI3K家族其他成员相关。