抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体的制备和应用

目的:拟研制能特异性识别血浆中人血管性血友病因子前导肽(VWF propeptide,VWFpp)的单克隆抗体,并且通过获得的抗VWFpp的单克隆抗体利用双抗体夹心法建立快速而可靠的检测血浆中VWFpp抗原的方法。方法:使用真核表达的重组人VWFpp(D1、D2区)蛋白作为免疫原,以常规方法免疫BALB/c小鼠,获取融合细胞的生长克隆,经过筛选和鉴定后,挑选能特异性分泌VWFpp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,然后应用ELISA双抗体夹心法构建VWFpp抗原检测试剂盒,用于人血浆VWFpp的测定,对收集的12例行骨髓移植的白血病患者血浆进行VWFpp抗原水平动态检测。结果:最终获得两株可持续传代并分泌VWFpp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并分别命名为SZ175和SZ176。经ELISA和Western blot鉴定,抗体能特异性识别VWFpp而不能识别成熟的VWF(不含前导肽)。利用双抗体夹心ELISA的原理,将单克隆抗体SZ175和SZ176成功制备成检测VWFpp抗原的试剂盒,动态检测白血病患者骨髓移植前后血浆中的VWFpp水平,结果显示移植后较移植前血浆中VWFpp水平有明显上升。结论:本研究成功制备两株抗VWFpp单克隆抗体,并且建立了VWFpp抗原双抗体夹心检测试剂盒,为进一步研究VWFpp的生物学功能以及血管性血友病临床诊断分型和内皮损伤相关疾病的预后监测提供了有力的工具。

多肿瘤标志物蛋白芯片检测在老年人健康体检中的应用价值及其临床意义

目的：探讨多肿瘤标志物蛋白芯片技术（C12芯片法）在老年人健康体检中的应用,并量化分析不同年龄和性别体检者肿瘤标志物检测值和阳性率的差别,阐明其临床意义。方法：选择健康体检者9 654人,按年龄分为对照组（40-59岁）、老年组（60-79岁）和高龄组（80岁及以上）。采用多肿瘤标志物芯片检测系统检测各组体检者甲胎蛋白（AFP）、糖链抗原15-3（CA15-3）、糖链抗原19-9（CA19-9）、糖链抗原125（CA125）、糖链抗原242（CA242）、癌胚抗原（CEA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、铁蛋白（ferritin）、β-人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）、人生长激素（HGH）、前列腺特异性抗原（PSA）和游离PSA（f-PSA）共12项肿瘤标志物水平,以超出正常范围为阳性结果,分析3组体检者样本的肿瘤标志物检测值和阳性率。结果：1体检者9 654人中共检出阳性结果665人,阳性检出率为6.89%,其中32人经内窥镜、病理学和影像学检查确诊为早期或中期肿瘤,肿瘤检出率为0.33%。2男女体检者肿瘤标志物阳性率不同,男性前5位依次为f-PSA、PSA、CEA、CA19-9和NSE;女性前5位依次为CA19-9、CA125、CEA、NSE和CA242。3 CA19-9、CA242、CEA、NSE、PSA和f-PSA阳性率分布呈随年龄增长而升高的趋势（P〈0.01）。4各组体检者AFP、CA125、CA19-9、CA242、CEA、HGH、NSE和PSA检测值随着年龄增长而升高,高龄体检者上述指标高于老年组和对照组（P〈0.01）,老年组上述指标高于对照组（P〈0.01）。结论：C12芯片中CA19-9、CEA、NSE、PSA和f-PSA等肿瘤标志物在老年人、尤其是高龄老年人的健康筛查中阳性率高,有助于发现早期肿瘤。

建立改良型人NK细胞体外扩增技术

目的建立一种改良型的NK细胞扩增技术。方法分离4名健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APC-mb IL-21和IL-2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和NK细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性实验检测杀伤效率。结果经过21 d的刺激培养,NK细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度最高可达95.86%。杀伤实验结果显示,扩增的NK细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。结论 p APC-mb IL-21工程细胞联合IL-2能够在体外高效的扩增出具有较高杀伤活性的NK细胞,可以为NK细胞免疫治疗奠定基础。

多肿瘤标志物蛋白芯片连续3年筛查对肿瘤检出率的影响

目的探讨多肿瘤标志物蛋白芯片(C12芯片)连续3年筛查对肿瘤检出率的影响。方法收集某高校40周岁及以上身体键康、无肿瘤病史教师2013-2015年连续3年的健康体检C12芯片检测结果,分析C12芯片连续筛查对肿瘤检出率的影响。按照年龄分为中年组(40~59岁)、老年组(60~79岁)和高龄组(≥80岁),比较不同性别和年龄组肿瘤标志物的阳性率和检测值的特点。结果共3634名教师完成了连续3年的C12芯片检测及相应的随访。汇总11017例的C12芯片检测结果分析表明,其中1027例有1项或多项标志物阳性,阳性率为9.32%。中年组、老年组和高龄组体检者肿瘤标志物总阳性率分别为4.45%、10.84%和26.97%,随年龄的增大而升高(P<0.01)。再次检测后仍超过正常值2倍以上的受检者行进一步检查,肿瘤指标单次,连续2次和连续3次阳性的体检者,肿瘤检出率分别为1.46%,6.07%和7.08%,肿瘤检出率随肿瘤标志物持续阳性次数的增多而增大(P<0.01)。结论C12芯片检测的肿瘤标志物总阳性率和肿瘤检出率随年龄增大而增高,肿瘤检出率随肿瘤标志物持续阳性次数的增多而增大,C12芯片连续检测有助于提高肿瘤检出率。

PD-1在急性T淋巴细胞白血病细胞中的表达及其临床意义

目的:探讨PD-1分子在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者来源的肿瘤细胞(T-ALL细胞)中的表达及其临床意义。方法:选用2015年12月江苏省中医院血液科提供的1例T-ALL细胞、4例健康志愿者提供的PBMC和博生吉医药科技(苏州)有限公司提供的人293T/PD-1细胞,将T-ALL细胞经尾静脉注射到B-NDG小鼠构建T-ALL细胞异种移植瘤模型,用流式细胞术检测移植瘤小鼠脾中获得的细胞是否主要是由T-ALL细胞组成。用流式细胞术检测T-ALL细胞中PD-1蛋白的表达,用RT-PCR进一步验证T-ALL细胞中PD-1 m RNA表达水平。对T-ALL细胞中PD-1基因进行SNP测序,以检测PD-1基因DNA序列是否发生改变。在体外使用PD-1抑制剂研究其对T-ALL细胞增殖、凋亡以及相关因子mRNA表达水平的影响。结果:成功构建小鼠TALL细胞异种移植瘤模型,用流式细胞术确认了该例疾病是T-ALL。T-ALL细胞中PD-1 mRNA和蛋白均高表达(均P<0.01)。PD-1基因的第5个外显子的一个碱基由胞嘧啶突变成胸腺嘧啶。在体外PD-1抑制剂对T-ALL细胞的增殖和凋亡均无明显影响;PD-1抑制剂上调抑癌蛋白IGFBP3 mRNA表达,降低促癌蛋白SULT1A3 mRNA表达(均P<0.01)。结论:PD-1在T-ALL细胞中高表达,PD-1可作为临床上T-ALL诊断及治疗的靶点。

家族性蛋白C与蛋白S基因联合杂合突变家系的基因变异特点与临床特征分析

目的:对1个蛋白C和蛋白S基因联合杂合突变的家系进行各项抗凝功能检测、基因诊断及临床特征分析。序法(Sanger测序法)检测基因突变。结果:在该家系中发现多人为遗传性蛋白C与蛋白S联合杂合突变,其中6位家族成员伴有深静脉血栓症状。结合家族中各成员的相关基因变异特点和临床表现,分析了遗传因素和继发性因素对该家系成员静脉血栓发病的影响。结果显示该家系中,蛋白C与蛋白S基因联合缺陷携带者有更高的静脉血栓发生率,但后天继发性因素仍对其最终是否出现血栓症状起重要作用。结论:静脉血栓形成是多因素导致的疾病,蛋白C合并蛋白S基因联合杂合突变是重要的遗传因素,临床上具有较大的异质性,继发性因素使静脉血栓栓塞症的发生率提高。

转录因子Pax5可不依赖与启动子结合促进B细胞淋巴瘤生长

目的:研究B淋巴细胞转录因子Pax5是否可以经过不依赖与启动子直接结合方式控制B细胞淋巴瘤的生长。方法:将可以产生各种突变型pax5并带GFP荧光的逆转录病毒感染小鼠淋巴瘤细胞系myc3和38B9,48 h后应用流式细胞术检测GFP+淋巴瘤细胞的比例,然后将GFP+和GFP-淋巴瘤细胞一起继续培养或皮下移植至小鼠体内生长,体外每隔3 d或体内成瘤后重新检测GFP+细胞比例并确定其细胞周期参数和凋亡细胞的数量。结果:与正常对照组(migR-GFP,空载体)相比,突变型Pax5 mt 1-357及缺乏DNA结合功能的突变型Pax5 mt 304-358和野生型Pax5一样均能明显增加GFP+细胞比例(P<0.01),且S及G2/M期GFP+肿瘤细胞明显增多(P<0.01),但只有DNA结合功能的Pax5 mt 1-143与空载体对照一样无法使GFP+细胞比例增加(P>0.05),细胞周期也无明显改变(P>0.05)。结论:Pax5可以经过不依赖与起动子直接结合方式促进B细胞淋巴瘤在体内体外的生长,其主要功能是加速肿瘤细胞分裂而不是降低细胞凋亡。本研究为以Pax5蛋白特定区域作为治疗B细胞淋巴瘤新靶点提供了理论依据。

CD7纳米抗体衍生的CAR-T细胞对CD7阳性急性髓系白血病细胞的杀伤活性

目的:针对CD7阳性的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞开发一种新型的CD7嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD7-CAR-T),观察其对CD7阳性AML细胞的杀伤作用。方法:基于CD7纳米抗体序列、CD28和4-1BB共刺激域序列构建CD7-CAR慢病毒载体,包装病毒颗粒并与CD7蛋白阻断剂(protein expression blocker,PEBL)慢病毒共感染人T细胞,制备CD7-CAR-T;应用实时无标记动态细胞分析技术(real time cellular analysis,RTCA)验证CD7-CAR-T对CD7过表达的293T细胞的特异性杀伤能力,流式细胞术检测CD7-CAR-T对CD7高、中、低表达的AML细胞(KG-1、HEL、Kasumi-1细胞)的增殖和细胞因子分泌的影响。结果:成功构建CD7-CAR-T细胞并阻断其表面CD7的表达,与T细胞相比,CD7-CAR-T细胞可以抑制CD7-293T细胞的增殖并促进其分泌TNF、Granzyme B和INF-γ,可显著促进CD7阳性的KG-1细胞和HEL细胞的凋亡(t=147.1、P<0.01;t=23.57、P<0.01)和细胞因子分泌(P<0.05或P<0.01),而对低表达CD7的Kasumi-1细胞无显著影响(t=0.7058、P>0.05)。结论:CD7-CAR-T细胞能够特异性杀伤CD7阳性的AML细胞。

达雷妥尤单抗治疗多发性骨髓瘤研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性克隆性浆细胞疾病,约占血液系统恶性肿瘤的10%[1]。MM预后差异较大,目前尚不能治愈,大部分患者治疗后仍会面临复发问题。近年来,随着新药的不断涌现,单克隆抗体药物使MM的治疗获得了突破性进展。达雷妥尤单抗(daratumumab)作为首个批准用于治疗MM患者的CD38单克隆抗体药物,在复发或难治性MM(RRMM)及新诊断MM(NDMM)的治疗中均显示良好效果,已被国内外多个权威指南推荐用于NDMM及RRMM的治疗。

普乐沙福联合G-CSF在浆细胞疾病自体造血干细胞动员中的有效性及安全性

目的分析普乐沙福联合G-CSF在浆细胞疾病自体造血干细胞中动员的效果及安全性。方法回顾性分析2018年1月至2019年12月在北京大学人民医院使用普乐沙福联合G-CSF进行自体造血干细胞动员的浆细胞疾病患者的基线临床资料、采集成功率及不良反应。结果共纳入49例浆细胞疾病患者,多发性骨髓瘤(MM)39例(79.6%),淀粉样变性8例(16.3%),肾脏意义的单克隆免疫球蛋白沉积病(MGRS)2例(4.1%),肾功能不全16例(32.7%)。其他动员方案既往采集失败患者7例(14.3%)。使用普乐沙福动员后,中位采集次数1(1~3)次,中位采集天数2(1~3)d,一次采集成功47例(95.9%),两次采集累积成功率为100%。在16例肾功能不全的患者中,5例(31.3%)患者第1天采集成功,8例(50%)需要第2天采集,3例(18.8%)需要第3天采集。主要不良反应依次为乏力、失眠、腹痛、腹泻、头晕、关节痛。共37例患者行auto-HSCT,白细胞中位植活时间11(8~13)d,血小板中位植活时间11(9~26)d。结论普乐沙福联合G-CSF用于浆细胞疾病患者自体造血干细胞动员成功率高,不良反应少,即使在肾功能不全的患者中也具有较高的动员成功率。