IL-33亚型肝癌稳定转染细胞系的构建及体外生物学功能检测

目的构建小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33肝癌细胞的稳转细胞系并检测其对肝癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。方法通过PCR的方法克隆小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33基因并将其连接到慢病毒载体pRRL-Venus中。利用293T细胞包装慢病毒并分别感染小鼠肝癌细胞系hepa1-6,经流式分选单个YFP阳性细胞,培养得到稳定表达全长、分泌型、入核型IL-33的hepa1-6稳转细胞系。通过一系列体外实验研究小鼠全长,分泌型,入核型IL-33对hepa1-6细胞生物学功能的作用。包括CCK8检测细胞增殖,Annexin V和7AAD的流式染色检测细胞凋亡,PI流式染色检测细胞周期。结果成功克隆了小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33基因并成功构建了hepa1-6稳转细胞系;全长IL-33促进肝癌细胞增殖,分泌型和入核型IL-33抑制肝癌细胞增殖;全长IL-33能够抑制早期和晚期细胞凋亡,分泌型IL-33对细胞凋亡无明显影响,入核型IL-33对早期的细胞凋亡没有作用,但是能够抑制晚期的细胞凋亡。分泌型IL-33稳转hepa1-6细胞的细胞周期G1期比例增加,而小鼠全长IL-33和入核型IL-33对hepa1-6稳转细胞的细胞周期均无明显作用。结论成功构建了小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33 hepa1-6稳转细胞系;小鼠全长IL-33促进肝癌细胞生长,抑制肝癌细胞的凋亡;分泌型和入核型IL-33均能抑制肝癌细胞的增殖;分泌型IL-33稳转细胞增加G1期细胞比例,入核型IL-33抑制晚期细胞凋亡。这些结果为进一步研究全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33在肝细胞肝癌发展中的作用及其机制奠定了基础。

微环DNA诱导表达方法的优化和体内表达

目的通过对微环DNA的表达步骤进行优化来提高微环DNA的诱导表达量以及降低诱导表达后的母环污染,并利用微环DNA构建一个能进行体内活体成像的表达系统。方法通过改变诱导培养基中加入L-阿拉伯糖的次数以及改变培养时间来提高DNA表达量、降低母环污染。通过Furin和2A将靶基因和萤火虫素酶基因(luciferase)连接到微环DNA中,再利用高压水流动力学注射的方法使目的基因在小鼠体内表达,通过活体成像检测萤火虫素酶的表达信号来监控和检测目的基因的表达。结果成功提高了微环DNA的表达量,降低了质粒的母环污染,建立可通过活体成像系统鉴定靶基因表达的系统。结论通过对微环DNA表达过程的优化大大提高了DNA的表达量,并且可以通过构建的微环DNA系统来监测靶基因在体内的表达情况。