肝癌干细胞外泌体miR-196a增强肝癌细胞对多柔比星的耐药性

目的筛选肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的miRNA并分析其对肝癌细胞恶性生物学特征的影响。方法采用miRNA表达谱芯片分析肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的miRNA并鉴定miRNA对肝癌干细胞恶性表型的作用。采用不同浓度(0、150、300μmol/L)多柔比星处理细胞,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-196a表达水平的变化;分别采用肝癌干细胞来源外泌体(Exo-NC组)、转染miR-196a抑制剂处理后的外泌体(Exo-Inhibitor组)培养肝癌细胞,检测肝癌细胞的凋亡情况以及caspase3/7的活性。按照随机数字表法将裸鼠分为Do-PBS组、Do-Exo-Inhibitor组、Do-Exo-NC组,每组各5只,采用裸鼠移植瘤实验分析miR-196a对肝癌细胞裸鼠移植瘤模型的作用。结果本研究分离纯化了CD133^+Huh7干细胞培养上清中的外泌体,发现miR-7162-3p、miR-1910-5p、miR-3613-3p、miR-196a、miR-155-5p表达上调,miR-1246和miR-3613-5p表达下调。外泌体中miR-7162-3p、miR-196a和miR-155-5p对肝癌干细胞的自我更新能力具有重要影响;miR-1910-5p、miR-196a和miR-155-5p对肝癌干细胞的侵袭能力具有重要影响,其中miR-196a的抑制效果最显著。在反应24 h时,多柔比星浓度在0、150、300μmol/L时miR-196a的表达量分别为0.96±0.05、1.23±0.05和2.33±0.03,差异具有统计学意义(F=996.90,P<0.001);48 h时,多柔比星浓度在0、150、300μmol/L时miR-196a的表达量分别为1.02±0.07、2.35±0.05和2.89±0.55,差异具有统计学意义(F=303.00,P<0.001)。Exo-NC组肝癌细胞在多柔比星浓度为0和300μmol/L时的细胞凋亡率分别为9.37%±0.19%和11.64%±0.27%,Exo-Inhibitor组分别为18.80%±1.91%和22.79%±1.57%,差异均具有统计学意义(t=4.41,P=0.048;t=4.96,P=0.038)。未使用多柔比星处理时,Exo-NC组在24 h和48 h的caspase3/7比值分别为0.94±0.08和0.97±0.09,Exo-Inhibitor组分别为1.56±0.01和1.58±0.01,差异均具有统计学意义(t=11.41,P=0.008;t=6.07,P=0.026)。使用300μmol/L多柔比星处理细胞后,Exo-NC组在24 h和48 h的caspase3/7比值分别为0.95±0.07、1.36±0.08,Exo-Inhibitor组分别为2.84±0.08、3.20±0.14,差异均具有统计学意义(t=24.20,P=0.002;t=15.78,P=0.004)。Do-PBS组、Do-Exo-Inhibitor组和Do-Exo-NC组3组裸鼠的移植瘤体积依次增大,分别为(1051.86±89.90)mm^3、(1310.91±86.66)mm^3和(2185.14±352.34)mm^3,差异具有统计学意义(F=30.28,P<0.001);3组移植瘤重量依次增加,分别为(0.36±0.10)g、(0.39±0.12)g和(0.76±0.16)g,差异具有统计学意义(F=11.81,P=0.002);转染miR-196a抑制剂后裸鼠移植瘤肿瘤内miR-196a的表达显著降低,3组表达量分别为1.05±0.16、0.38±0.08和2.17±0.26,差异具有统计学意义(F=48.93,P<0.001)。结论肝癌干细胞分泌的外泌体可通过其中的miR-196a增强肝癌细胞对多柔比星的耐药性。