膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损

背景:采用膀胱无细胞基质作为游离移植物修复尿道缺损,诱导尿道再生取得一定的成果,但该方法仍未能从根本上解决移植物血管再生不足的问题。目的:观察复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损的效果。方法:将30只成年新西兰大白兔随机分为5组,每组6只,模型组、对照组、实验组均制作尿道缺损模型,随后对照组、实验组分别采用猪膀胱脱细胞基质、复合血管内皮生长因子的猪膀胱脱细胞基质进行修复,同时设立正常组、假手术组。术后4,12周分批处死动物,进行尿道造影、尿流率及免疫组织化学检测。结果与结论:(1)实验组术后4,12周的平均尿流率高于模型组、对照组(P <0.05),与正常组、假手术组比较无差异;(2)术后12周尿道造影显示,实验组尿路线条流畅;模型组、对照组尿路线条欠流畅;(3)苏木精-伊红染色显示,模型组胶原纤维细胞较多,纤维排列紊乱,有较多淋巴细胞浸润;实验组胶原基质基本降解,新生胶原纤维排列规律,其间血管较多,未见血管瘤等;对照组见团块状胶原沉积,视野内血管较少;(4)术后12周Masson染色显示,实验组胶原组织沉积明显少于对照组、模型组(P <0.05),接近正常组和假手术组(P> 0.05);(5)术后12周CD31染色显示,实验组新生血管数量明显多于对照组、模型组(P> 0.05),接近正常组和假手术组(P> 0.05);(6)术后12周a-SMA免疫组织化学染色显示,实验组再生肌肉含量明显高于对照组和模型组(P <0.05),接近正常组和假手术组(P> 0.05);(7)结果表明,复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损,可促进移植物局部血管新生,提高再生尿道肌肉含量,加速局部胶原降解,改善尿道再生微环境,促进尿道更好地再生。

不同质量浓度粒巨噬细胞集落刺激因子对Lewis大鼠骨髓源性树突状细胞诱导分化的影响

背景：体内成熟和不成熟树突状细胞（dendritic cells,DC）数量极少,仅占外周血单核细胞的1%,占脾细胞的0.2%-0.5%,几乎不能直接从体内分离出大量的纯化的DC,要获得足够的DC,只有依靠体外培养增殖。目的：以不同剂量粒巨噬细胞集落刺激因子诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,拟建立合适的大鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-06/2008-05在苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室和附属儿童医院骨科实验室完成。材料：雄性SPF级Lewis大鼠用于培养骨髓源性DC,雄性SPF级Brown Norway大鼠用于混合淋巴细胞反应实验。方法：采用密度梯度离心法从Lewis大鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单个核细胞,分别以2.5,5,10,20μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子和5μg/L白细胞介素4诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,采用黏附法纯化DC。主要观察指标：以流式细胞仪分析DC表型。混合淋巴细胞反应中以Lewis大鼠DC作为刺激细胞,以Brown Norway大鼠脾脏T细胞作为反应细胞,检测其刺激同种T细胞增殖能力。ELISA测定分泌细胞上清液中白细胞介素12、干扰素水平。结果：随粒巨噬细胞集落刺激因子质量浓度的增高,诱导的细胞获得率逐渐升高,但DC比例逐渐下降。CD86、MHC-II表达阳性率随培养时间延长逐渐增加。培养第5,7天,DC不能有效刺激同种异体T细胞的增殖反应,培养第13天,DC刺激同种异体T细胞的增殖反应能力明显增强（P〈0.01）。培养7d以后,DC上清液中白细胞介素12水平明显增高（P〈0.01）,脂多糖刺激以后升高更加明显（P〈0.01）。脂多糖刺激后DC表型MHCII、CD86表达明显增加,白细胞介素12分泌增加,刺激同种T细胞增殖能力轻度增强。结论：5μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子为诱导大鼠骨髓源性未成熟DC的最佳剂量,培养9d可以获得足够数量和纯度的未成熟DC。

鼠脂肪干细胞的分离、培养和鉴定

目的：研究脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）的分离、培养和鉴定的方法,为组织工程、细胞疗法、基因疗法提供可靠的细胞来源。方法：采用反复贴壁法从小鼠脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞,观察其细胞形态,MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪对干细胞表面标志物进行鉴定,采用不同诱导液对脂肪干细胞进行诱导,鉴定其多系分化能力。结果：接种后第2 d,大多数呈纺锤形,少数呈三角形、多角形等形状。至第5 d左右,呈成纤维细胞样梭形细胞。至第9-10 d,细胞呈均一的梭形;传代细胞形态与原代细胞类似,但生长速度加快,生长曲线为＂S＂形曲线。经测定CD90阳性细胞达到96.6%;CD44阳性细胞数达到85.3%;CD11b、CD45阳性细胞均为0.5%。经油红O染色检测,诱导的干细胞胞质中的脂滴被染为红色;碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色表现为细胞内灰黑色或黑色颗粒,Von Kossa染色表现为细胞内可见黑色的矿化结节;用阿尔新蓝染色检测,将软骨结节样结构染成蓝色。结论：反复贴壁法可以从小鼠脂肪组织中分离出ADSCs,具备干细胞的各项特征,为干细胞的临床应用提供丰富的干细胞来源。

MiR-146a 在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中作用机制的研究

目的：探讨长波紫外线（UVA）诱导人皮肤成纤维细胞（HSF）光老化中 miR-146a 的表达情况，以及上调 miR-146a 表达对其靶基因 Smad4及细胞光老化的影响。方法以10 J/cm2 UVA 照射 HSF （UVA 照射组），分别在0、3、7、14 d 提取 RNA，实时定量 PCR 检测 miR-146a 的表达量。通过慢病毒转染上调 miR-146a 的表达（miR-146a 过表达组），在7 d、14 d 后用荧光显微镜观察转染效率，并通过实时定量 PCR 验证细胞内miR-146a 表达量。空白对照组为正常培养的 HSF（不做任何处理），miR-146a 过表达组为慢病毒转染 HSF 后，再用 UVA 照射。MTT 法检测空白对照组、UVA 照射组、miR-146a 过表达组、miR-146a 过表达组细胞增殖吸光度（A 值），实时定量 PCR 检测各组细胞内老化相关基因 p53、p16和 p21 mRNA 的表达，Western 印迹法检测各组细胞内 Smad4蛋白表达。采用重复测量的方差分析、析因设计的方差分析进行统计学分析。结果重复测量的方差分析显示，随培养时间的延长，UVA 照射组和空白对照组 miR-146a 的表达量均逐渐下降（F =213.840， P 〈0.01）；UVA 照射组表达量低于空白对照组（F =52.55，P 〈0.01），且照射时间越长，下调越明显。慢病毒转染HSF 后，细胞内均有较高的荧光表达，miR-146a 过表达组在第7天（10.31±0.17）与第14天时（9.65±0.19）的miR-146a 表达量差异无统计学意义（P 〉0.05），但较空白对照组（分别为8.33±0.13和7.86±0.11）显著增高，组间差异有统计学意义（F =42.49，P 〈0.01）。析因设计的方差分析显示，UVA 照射对细胞增殖活性有抑制作用（P 〈0.01），UVA 照射组、UVA ＋ miR-146a 组细胞增殖均分别低于空白对照组、miR-146a 过表达组（P 〈0.01）；慢病毒转染上调 miR-146a 的表达对细胞增殖活性也有影响（P 〈0.01），但 miR-146a 过表达组与空白对照组差异无统计学意义（P 〉0.05），UVA ＋ miR-146a 组显著高于 UVA 照射组（P 〈0.01）。实时定量 PCR 和 Western 印迹法结果显示，UVA 照射可上调 p21、p53、p16 mRNA 的表达（均 P 〈0.01），同时对细胞内 Smad4蛋白表达有促进作用（P 〈0.01）；UVA 照射组、UVA ＋ miR-146a 组 p21、p53、p16 mRNA 和 Smad4蛋白表达均分别高于空白对照组、miR-146a 过表达组（均 P 〈0.01），而 miR-146a 过表达组与空白对照组相比差异均无统计学意义（均 P 〉0.05）， UVA ＋ miR-146a 组均显著低于 UVA 照射组（均 P 〈0.01）。结论在 UVA 诱导光老化的 HSF 中，miR-146a 的表达受到抑制，上调其表达能够抑制 Smad4的表达，促进光老化细胞增殖，起到抗细胞光老化的作用。