免疫因子sB7-H3与高血压合并颈动脉粥样硬化

目的探讨新型共信号分子sB7-H3在高血压合并颈动脉粥样硬化的表达情况,进一步探讨免疫反应与心血管病的关系。方法利用苏州大学研制的新型共信号分子sB7-H3酶联免疫检测试剂盒及鼠抗人sB7-H3单克隆抗体,运用ELISA及免疫组化技术分析168例高血压伴颈动脉粥样硬化斑块者(观察组)血清sB7-H3浓度的情况,以单纯高血压无颈动脉粥样硬化病人162例为对照组,50名健康志愿者为健康组。结果与对照组相比,在颈动脉粥样硬化病人血清当中可溶性sB7-H3蛋白较高[观察组(33.3±12.5)μg/L与对照组(21.8±10.2)mg/L比较,P<0.01]。结论sB7-H3表达水平升高提示患者体内有免疫炎症反应,进一步证实了免疫参与动脉粥样硬化的发生与发展。

新型共信号分子B7-H3表达水平与急性心肌梗死预后的关系

目的:探讨新型共信号分子B7-H3在急性心肌梗死(AMI)的表达情况,进一步探讨其与AMI预后的关系。方法:运用ELISA及免疫组化技术观察B7-H3在116例AMI患者的表达情况,同时把AMI患者B7-H3的检验结果与预后的关系进行分析,判断其是否有相关性。结果:AMI患者1年内心血管事件发生者比未发生者血浆B7-H3水平明显升高(P<0.05)。结论:血浆B7-H3升高的幅度与AMI后患者心血管事件的发生有一定关系。

sB7-H3与原发性高血压患者尿微量白蛋白的关系

目的本研究旨在探讨新型共信号分子B7-H3在高血压合并微量蛋白尿的表达情况,进一步探讨免疫反应与肾损害的关系。方法本研究利用苏州大学研制的新型共信号分子B7-H3酶联免疫检测试剂盒及鼠抗人B7-H3单克隆抗体,运用ELISA分析该分子在96例高血压伴微量蛋白尿的表达情况。结果与对照组比较,在伴有微量白蛋白尿患者血清当中含有更高水平的可溶性B7-H3蛋白(sB7-H3观察组(35±11)μg/L,对照组(23±9)μg/L(P<0.01)。结论该项研究表明,sB7-H3升高与高血压伴微量蛋白尿有关系。进一步提示免疫反应参与了肾损害的发生发展。

一株识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

目的:以本科室发现肿瘤细胞上表达的CD4078AA突变为基础,研制识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性作初步分析。方法:以转人CD40突变体转基因细胞L929-CD40mu为免疫原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929-CD40mu转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,免疫荧光标记法对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析该mAb的亚类及抗原识别位点;免疫印迹法对该mAb进行鉴定;采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的抑制增殖效应以及PI-annexinⅤ方法进行细胞凋亡测定。结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD40mumAb的杂交瘤细胞株(命名为10C5),该mAb能特异性地识别人肿瘤细胞株HO8910表达的CD40突变体分子,而不识别正常扁桃体B淋巴细胞及血管内皮细胞表达的CD40分子,并且能够在体外促进肿瘤细胞凋亡。结论:成功地研制出1株特异性识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的mAb,该mAb具有体外抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的作用。

人B7-H3两种异构体基因转染细胞株的建立及对T细胞协同刺激作用的比较

目的 建立2IgB7-H3基因转染细胞株和4IgB7-H3基因转染细胞株,探讨B7-H3两种异构体对T细胞的协同刺激作用.方法 RT-PCR 法从诱导成熟的DC细胞中克隆人B7-H3两种异构体基因2IgB7-H3和4IgB7-H3的编码区,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体构建pIRES2-EGFP/2IgB7-H3和pIRES2-EGFP/4IgB7-H3重组子,采用脂质体法转染脑胶质瘤细胞株SHG44.经G418抗性筛选,采用免疫荧光标记和流式细胞术分析2IgB7-H3和4IgB7-H3在SHG44细胞上的表达.继而,利用MTT法和酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析两种异构体基因转染细胞株对T细胞体外增殖和细胞因子的分泌.结果 成功构建了可以稳定表达2IgB7-H3和4IgB7-H3的基因转染细胞株.体外生物学功能分析表明,与转染空载体的SHG44/mock细胞相比,SHG44/2IgB7-H3和SHG44/4IgB7-H3均能有效抑制T细胞增殖以及对IFN-γ的分泌,且两者的协同抑制作用不存在显著差异.结论 B7-H3两种异构体分子均能负性调控T细胞介导的免疫应答,但两者的生物学功能并不存在显著的差异.

人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的分子机制探讨

本文拟通过氨基酸序列比对方法分析序列高度重复的人4IgB7-H3与2IgB7-H3两种异构体的序列差异,并探讨该差异在可溶性形式产生中发挥的机制。运用拼接PCR的方法获得缺失6个保守性氨基酸"PQRSPT"的4IgB7-H3-Del基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/4IgB7-H3-Del,通过脂质体转染法将其导入L929细胞,并经G418抗性筛选和亚克隆。通过RT-PCR、流式细胞术和Western blot检测基因转染细胞B7-H3的表达,采用Western blot和ELISA方法检测细胞培养上清中sB7-H3的表达。本文成功克隆和构建了真核表达载体并获得基因转染细胞株L929/4IgB7-H3-Del,流式细胞术、Western blot和ELISA方法检测结果表明,4IgB7-H3转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,细胞培养上清中无sB7-H3蛋白,而4IgB7-H3-Del转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,其培养上清中则有大量sB7-H3的存在,提示保守性氨基酸"PQR-SPT"可能是人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的重要序列。

人TLT-2真核表达载体的构建及其在L929细胞株中的稳定转染

目的构建含有人TLT-2基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达TLT-2分子的L929转基因细胞株。方法运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从健康人外周血单个核细胞(PBMC)的cDNA文库获得全长TLT-2基因,经过双酶切(XhoI和EcoRI)装入逆转录病毒表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选,流式细胞术、RT-PCR及Western blot鉴定TLT-2分子的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/hTLT-2,建立了稳定转染TLT-2目的基因的L929细胞株。结论成功构建了TLT-2真核表达载体并获得了稳定转染该分子的转基因细胞,为进一步研究人TLT-2分子的生物学功能提供了物质基础。

一株特异性识别4IgB7-H3单克隆抗体的研制及其生物学特性的初步分析

研制特异性识别人4IgB7-H3的鼠单克隆抗体,并对其生物学特性和4IgB7-H3分子的表达特性进行初步分析。以高表达人4IgB7-H3的293T细胞为免疫原,常规免疫小鼠、细胞融合和筛选。L929/4IgB7-H3细胞为抗体筛选阳性细胞,L929/2IgB7-H3为抗体筛选阴性细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术对杂交瘤细胞进行反复筛选和多次亚克隆化,获得l株能稳定分泌特异性识别人4IgB7-H3的鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株9C3。经位点竞争实验对该抗体抗原表位的识别特异性进行了鉴定。继而利用该单抗,采用流式细胞术检测4IgB7-H3在肿瘤细胞株和免疫细胞上的表达特性。结果表明,蛋白水平上4IgB7-H3非常有限地表达在一些肿瘤细胞株,人外周血单核细胞以及上调性表达在成熟的树突状细胞。而2IgB7-H3分子广泛地表达在各种肿瘤细胞株、持续性表达在单核细胞和分化不同阶段的DC。这与先前研究所揭示的4IgB7-H3在mRNA水平的表达远高于2IgB7-H3不相一致,提示2IgB7-H3分子可能是B7-H3发挥生物学功能的主要形式。鉴此,4IgB7-H3单克隆抗体9C3的成功获得为进一步分析人B7-H3两种剪切体的表达特性及生物学功能提供了新的实验手段。