PD-L1分子在肺癌细胞株上的表达及其生物学意义

背景与目的目前研究表明,多种人类肿瘤大量表达的PD-L1分子参与了肿瘤免疫逃逸,其机制主要在于肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子,与T细胞上的受体PD-1的结合,传递负性调控信号,导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡和免疫无能。本文着重探讨PD-L1分子在肺癌细胞株上的表达及其对T细胞杀伤效应的调节作用。方法采用常规方法从健康人外周血单个核细胞诱导DCs,并经凋亡肿瘤细胞和激发型CD40单克隆抗体刺激获得成熟DCs,与自体T细胞共育后获得肿瘤特异性CTL细胞;流式细胞术检测肺癌细胞上PD-L1分子的表达;JAM法和单抗阻断实验分析CTL细胞对肺癌细胞株的杀伤效应,ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的含量。结果经凋亡肿瘤细胞负载的成熟DCs可诱导自体T细胞分化为肿瘤特异性CTL;H1299高表达PD-L1分子(90.3±4.2)%,而A549低表达PD-L1分子(19.4±5.2)%;CTL对A549具有高效特异的杀伤力,而对H1299不能高效杀伤;联合应用PD-L1单抗可促进CTL对H1299的杀伤作用和IFN-γ的分泌(P<0.05)。结论在肺癌细胞株上表达的PD-L1分子,可降低CTL对肺癌细胞的杀伤效应。

B7-H3单抗交联作用对Mo-DC体外生物学功能的影响

探讨B7-H3分子对人外周血单核细胞来源树突状细胞(Mo-DC)体外成熟和生物学功能的影响。采用常规方法从健康人外周血单核细胞诱导DC,在诱导过程中,加入B7-H3单抗21D4共培养,经流式细胞术检测Mo-DC上B7-H3分子和其他共刺激分子的表达,ELISA试剂盒检测培养上清中细胞因子IL-10和IFN-γ的分泌量,并采用3H-TdR掺入法测定T细胞的增殖。结果:B7-H3分子在未成熟和成熟Mo-DC上均有高水平表达,抗人B7-H3单抗21D4能上调Mo-DC表面CD80、CD86和CD83的表达,提高Mo-DC的共刺激能力,促进T细胞的体外增殖,并能显著促进T细胞分泌IL-10。由此表明,B7-H3单抗21D4交联作用可以促进Mo-DC体外成熟,上调其共刺激T细胞的能力。

重组hIL-17F原核蛋白表达和生物学活性初步研究

目的:研制hIL-17F/His重组蛋白并初步研究其体外生物学活性。方法:RT-PCR法克隆得到hIL-17F基因序列。将测序正确的hIL-17F基因片段装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17F/PQE3.0。将该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基B-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后产生hIL-17F/His重组蛋白,并用Western blot实验确认。结果:原核表达的hIL-17F/His重组蛋白变性、复性后,经过HiTrapTM亲和层析得到纯品蛋白。体外活性实验表明,该融合蛋白具有上调人巨噬细胞TNF-α、IL-6等分子表达的作用,并促进He-La细胞的增殖。结论:制备了具有生物学活性的hIL-17F/His重组蛋白,为进一步研究该分子独特的生物学功能奠定了基础。

一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的:鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法:以高表达人4-1BBL分子的基因转染细胞L929/4-1BBL为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交瘤技术进行细胞融合,经流式细胞术分析和多次克隆化培养,筛选特异性杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法对单抗的生物学特性进行鉴定,并采用体外细胞计数和ELISA检测分析单抗对单核细胞的作用。结果:获得1株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BBL单抗的杂交瘤细胞株,命名为3E7。该单抗能识别人白血病细胞株和单核细胞表面的4-1BBL分子。对单抗生物学功能的研究结果表明,该单抗能有效地促进外周血单核细胞体外生长,并促进IL-6和TNF-α的分泌。结论:成功地获得了一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体3E7,该单抗能特异地识别人4-1BBL分子,并有效地通过激发4-1BBL逆向信号通路促进单核细胞的体外生长及细胞因子的分泌。

朗格汉斯细胞在神经性皮炎组织中的分布和CD40分子表达

通过分析神经性皮炎组织病理变化、炎性细胞浸润、朗格汉斯细胞(LC)的分布以及CD40分子的表达,探讨这些变化与临床分型及病程的相关性。应用常规病理切片分析以及免疫组化的方法,观察LC和CD40分子在不同病期和炎症浸润程度皮损中的分布和表达情况。结果显示神经性皮炎组织呈现慢性炎症反应,炎症细胞的浸润,LC向真皮迁移以及CD40分子表达增加,这些均与疾病严重程度相关。基此表明LC分布的改变和CD40分子的表达与神经性皮炎免疫病理变化有密切的相关性。

可溶性B7-H3在早期预测急性胰腺炎严重程度中的临床意义

目的:探讨s B7-H3(可溶性B7-H3)对早期判断急性胰腺炎(AP)严重程度的临床价值。方法:选择AP患者75例(轻度MAP 30例、中度MSAP 20例、重度SAP 25例),对照组为健康(HC)组20例,采用双抗体夹心ELISA法测腹痛开始24 h血浆s B7-H3值,评价与胰腺炎严重程度关联性的敏感度和特异度,及与临床检测指标相关性分析。结果:腹痛24 h血浆s B7-H3值,AP组显著高于对照组(t=3.925,P=0.0002),MAP组与HC相相比差异没有显著性,MSAP组和SAP组均显著高于HC组(P<0.05和P<0.01)和MAP组(P<0.05和P<0.01);SAP组显著高于MSAP组(P<0.01)。s B7-H3与LDH、hs-CRP、WBC呈线性正相关,与ALB、Ca(S)呈线性负相关(均P<0.05);s B7-H3对判断中度以上胰腺炎敏感度为88.9%,特异度为83.3%,判断SAP的敏感度为96%,特异度96%。结论:s B7-H3对急性胰腺炎严重程度早期判断有重要临床价值,同时有很高的敏感度、特异度,与临床判断严重程度指标呈线性相关。

pCEP4/hIL-17真核表达载体的构建及表达

目的构建pCEP4/hIL-17载体及在真核细胞中表达hIL-17/mFc融合蛋白;初步研究IL-17生物学特性。方法采用RT-PCR的方法克隆hIL-17CDS段基因序列;将测序正确的hIL-17序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/IL-17真核表达载体,转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞后,筛选阳性表达细胞株;并用RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定IL-17基因的mRNA和蛋白表达;流式细胞术分析纯化的蛋白对Raji细胞表达的hIL-17受体的结合能力;以体外实验验证其促炎症作用。结果成功构建了pCEP4/hIL-17重组载体,并在CHO细胞中稳定表达;所获得hIL-17重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17受体;体外刺激HeLa细胞,能明显促进IL-6等炎症因子的分泌。结论稳定表达hIL-17重组蛋白的CHO细胞系的建立,为进一步研究hIL-17的生物学功能奠定了良好的基础。

不同质量浓度粒巨噬细胞集落刺激因子对Lewis大鼠骨髓源性树突状细胞诱导分化的影响

背景：体内成熟和不成熟树突状细胞（dendritic cells,DC）数量极少,仅占外周血单核细胞的1%,占脾细胞的0.2%-0.5%,几乎不能直接从体内分离出大量的纯化的DC,要获得足够的DC,只有依靠体外培养增殖。目的：以不同剂量粒巨噬细胞集落刺激因子诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,拟建立合适的大鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-06/2008-05在苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室和附属儿童医院骨科实验室完成。材料：雄性SPF级Lewis大鼠用于培养骨髓源性DC,雄性SPF级Brown Norway大鼠用于混合淋巴细胞反应实验。方法：采用密度梯度离心法从Lewis大鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单个核细胞,分别以2.5,5,10,20μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子和5μg/L白细胞介素4诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,采用黏附法纯化DC。主要观察指标：以流式细胞仪分析DC表型。混合淋巴细胞反应中以Lewis大鼠DC作为刺激细胞,以Brown Norway大鼠脾脏T细胞作为反应细胞,检测其刺激同种T细胞增殖能力。ELISA测定分泌细胞上清液中白细胞介素12、干扰素水平。结果：随粒巨噬细胞集落刺激因子质量浓度的增高,诱导的细胞获得率逐渐升高,但DC比例逐渐下降。CD86、MHC-II表达阳性率随培养时间延长逐渐增加。培养第5,7天,DC不能有效刺激同种异体T细胞的增殖反应,培养第13天,DC刺激同种异体T细胞的增殖反应能力明显增强（P〈0.01）。培养7d以后,DC上清液中白细胞介素12水平明显增高（P〈0.01）,脂多糖刺激以后升高更加明显（P〈0.01）。脂多糖刺激后DC表型MHCII、CD86表达明显增加,白细胞介素12分泌增加,刺激同种T细胞增殖能力轻度增强。结论：5μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子为诱导大鼠骨髓源性未成熟DC的最佳剂量,培养9d可以获得足够数量和纯度的未成熟DC。

抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段的构建和表达

目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区基因。利用基因重组技术构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab,利用大肠杆菌表达简单,高效,成本低廉的特点,对重组Fab进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳、Western blot、流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征。表达质粒pTXB1-Fab构建正确,在大肠杆菌中实现可溶性表达。表达的人-鼠嵌合抗体与亲本抗体具有相同的识别位点。结论:成功地克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)的轻链、重链可变区基因,成功构建pTXB1-Fab共表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,为人源化抗体的制备奠定了技术基础。

人可溶性PD-1在肝病患者血清中表达检测及临床意义

目的利用自主研发的可溶性PD-1(soluble PD-1,s PD-1)检测试剂盒,检测肝病患者外周血中s PD-1表达水平并分析其临床意义。方法 40例初诊HBV感染患者,其中单纯HBV+患者13例、合并肝硬化患者17例以及合并肝癌患者10例。同时收集16例性别年龄匹配的健康人作为对照组。利用自主研发的PD-1 ELISA试剂盒分析s PD-1表达水平,并结合临床资料分析s PD-1与临床参数的相关性以及在鉴别诊断中的价值。结果 HBV感染患者体内s PD-1水平显著高于健康对照组(P<0.05);单纯性HBV感染组、合并肝硬化组以及合并肝癌组s PD-1水平(μg·L-1)分别为4.755±1.554、0.940 2±0.231 9和0.766 5±0.349 1。各肝病患者组之间s PD-1水平存在显著性差异(P<0.01);且单纯HBV感染组s PD-1水平显著高于合并肝硬化(P<0.05)以及合并肝癌组(P<0.01);肝硬化组和肝癌组两者之间s PD-1水平不存在显著差异(P>0.05)。s PD-1水平与临床检验指标如T-BIL、D-BIL、I-BIL、AST以及ALT呈线性正相关,有统计学意义(P<0.05);s PD-1与ALP、TP、H-ALB、UREA、Cr-s以及UA未见显著相关性(P>0.05)。ROC曲线分析发现,s PD-1在对健康照组与单纯乙肝患者鉴别中具有显著差异(P=0.002)。结论 s PD-1在单纯HBV感染患者体内显著升高,并在疾病进程呈现动态变化。提示其在肝病进展中可能发挥着重要的调控作用。

负性协同刺激分子B7-H4在小鼠树突状细胞上的表达及其生物学意义

目的探讨B7-H4分子在小鼠树突状细胞分化发育过程中的表达及其在T细胞活化中的作用。方法采用GM-CSF和IL4联合方案体外诱导小鼠髓系树突状细胞（DCs）；采用流式细胞术检测未成熟DCs、成熟DCs以及IL-10诱导的DCs表面B7-H4分子的表达；采用。H—TdR掺入试验和抗B7-H4单抗（McAb）阻断试验分析DCs表达的B7-H4分子对T淋巴细胞的共刺激效应。结果经GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导的未成熟DCs较高水平表达B7-H4，在IL-10作用下B7-H4表达进一步上调，经TNF-α刺激成熟后，B7-H4的表达显著下调，不同功能状态下DCs表面B7-H4分子均可抑制T细胞的增殖，但以未成熟DCs、IL-10诱导的DCs表面B7．H4分子的抑制作用更为显著。结论不同功能状态下的DCs均有B7-H4分子的表达，处于抑制状态下的DCs通过高表达B7-H4介导免疫不应答效应。

重组hIL-17B/His原核蛋白表达和生物学活性初步研究

目的研究原核表达hIL-17B/His重组蛋白及生物学活性。方法 RT-PCR法克隆去信号肽的hIL-17B基因序列。将测序后的hIL-17B分子扩增产物插入PQE3.0载体构建hIL-17B/PQE3.0重组载体。再将该重组载体导入M15工程菌,应用异丙基B-D硫代半乳糖苷诱导后表达hIL-17B/His重组蛋白,并经Western blot实验证实。结果获得原核表达的hIL-17B/His重组蛋白。体外实验表明,该融合蛋白具有上调人巨噬细胞TNF-α、IL-1β等分子表达的作用。结论原核表达获得具有生物学活性的hIL-17B重组蛋白,为进一步研究该分子的生物学功能提供了物质条件。

免疫检查点分子PD-L1和B7-H4在卵巢癌组织中的表达及意义

为探讨免疫检查点分子PD-L1和B7-H4在卵巢癌组织中的表达特点以及临床意义,收集46例手术切除的卵巢癌组织,通过免疫组化染色技术检测PD-L1和B7-H4分子的表达水平和定位,采用χ2检验分析其与样本临床参数之间的关系,Spearman法分析相关性。结果显示,PD-L1和B7-H4分子在卵巢癌组织内中/高表达所占百分比分别为67.4%(31/46)和82.6%(38/46),二者同时中/高表达率为58.7%(27/46)。膜PD-L1中/高表达与病理类型、分化程度有关(P<0.05),膜B7-H4中/高表达与病理类型有关(P<0.05);膜PD-L1与膜B7-H4的表达有相关性(r=0.553,P<0.05),浆PD-L1和浆B7-H4的表达有相关性(r=0.429,P<0.05)。该研究提示,卵巢癌组织中癌细胞膜表面PD-L1中/高表达提示肿瘤分化差,胞膜同时中/高表达PD-L1和B7-H4分子主要集中在卵巢透明细胞癌亚组,PD-L1与B7-H4在胞膜和胞浆的表达具有相关性,在免疫治疗卵巢癌时需考虑PD-L1和B7-H4抗体联合靶向干预。

肺结核与肺结节病相关肉芽肿组织中CXCR5的差异性表达

目的分析不同肺肉芽肿组织中CXCR5分子的表达差异及对肺结核与肺结节病的鉴别诊断意义。方法选择2016年1月至2022年12月我院收治的经支气管镜下肺组织活检确诊为肺肉芽肿性炎患者43例,其中肺结节病15例、肺结核病28例;应用免疫组织化学技术分析组织切片中CXCR5分子表达,采用双重免疫荧光标记法分析组织切片中CXCR5在CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞上的表达,进行定量评分。结果肺结核肉芽肿组织中CXCR5阳性表达大于2分22例(78.57%),表达强度大于2分12例(42.86%),定量评分小于3分10例(35.71%)、定量评分大于6分8例(28.57%);肺结节病肉芽肿组织中CXCR5阳性表达大于2分9例(60.00%),CXCR5表达强度小于2分15例(100.00%),定量评分小于3分11例(73.33%)。与肺结节病相比,肺结核肉芽肿组织中CXCR5分子表达强度升高,整体评分增加[(4.00±2.12)vs.(2.18±1.87)]分(P<0.05)。ROC分析表明,最佳cut-off值CXCR5表达定量评分为2.85分时,肺结核与肺结节病鉴别诊断AUC=0.733,特异性73.3%,敏感性64.3%。荧光共定位分析显示,和肺结节病相比,肺结核肉芽肿组织中滤泡CD4^(+)T细胞(0.7933 vs.0.5150)和滤泡CD8^(+)T细胞的(0.8350 vs.0.6100)浸润水平增加(P<0.05)。结论肺结核与肺结节肉芽肿组织中CXCR5及表面标记的滤泡CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的表达存在差异,具有鉴别诊断意义。

急性胰腺炎患者外周血髓源性抑制细胞表达膜型B7-H3的临床意义

目的探讨外周血髓源性抑制细胞（MDSC）以及膜型B7家族同源分子-3（B7-H3）在急性胰腺炎表达的临床意义。方法选择2014年1月至2015年12月间在苏州大学附属第一医院急诊科初诊的急性胰腺炎患者（AP）63例，其中轻度急性胰腺炎（MAP）25例、中度急性胰腺炎（MSAP）20例、重度急性胰腺炎（SAP）18例；对照组为年龄、性别匹配的健康人群组20例。诊断标准符合2013年中国急性胰腺炎诊治指南要求，并除外可能影响结果的其他基础疾病，如肿瘤、自身免疫病、病毒感染以及创伤等。利用流式检测分析外周静脉血MDSC表达比例以及MDSC膜上B7-H3表达情况，并对AP患者进行24、48、72h动态检测。采用完全随机设计重复测量的方差分析。结果AP发病24hMDSC细胞群体较健康对照组明显升高（P〈0．01），SAP组表达最高，MSAP组其次，均高于MAP组，各组两两比较差异有统计学意义（P〈0．05）；各组动态观察：MAP组、MSAP组发病24、48、72hMDSC差异无统计学意义，然而SAP组MDSC48h升至最高，72h下降，差异有统计学意义（P〈0．05）。AP发病24hMDSC模型B7-H3高表达，健康对照组几乎不表达；SAP组表达最高，MSAP组其次，均高于MAP组，各组两两比较差异有统计学意义（P〈0．05）；动态观察MDSC膜型B7-H3表达MAP组、MSAP组发病24、48、72h，膜型B7-H3表达差异无统计学意义，然而SAP组mB7-H3表达24、48、72h呈上升趋势，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论MDSC及MDSC膜型B7-H3在急性胰腺炎高表达，而且表达在MAP、MSAP、SAP中差异显著，对AP免疫紊乱的深入认识能更好指导临床实践。

可溶性B7-H2在早期急性胰腺炎严重程度判定中的应用及其临床意义

目的分析可溶性B7-H2(s B7-H2)表达差异,探讨s B7-H2在早期急性胰腺炎(AP)严重程度鉴别诊断中的临床价值。方法以2012年1月至2013年12月苏州大学附属第一医院住院的75例AP患者为研究对象,其中轻度急性胰腺炎(MAP)30例、中度急性胰腺炎(MSAP)20例以及重度急性胰腺炎(SAP)25例。同时收集健康体检者20名作为对照组。采用双抗体夹心ELISA法检测腹痛开始24 h的AP患者血浆s B7-H2值,分析其与胰腺炎严重程度关联性的敏感度和特异度,并分析s B7-H2与临床常用检测指标相关性。结果腹痛24 h的AP患者组血浆s B7-H2水平显著高于健康对照组(P<0.01),MSAP和SAP组血浆s B7-H2显著高于健康对照组和MAP组(P<0.05和P<0.01);SAP组血浆s B7-H2显著高于MSAP组(P<0.05)。s B7-H2与乳酸脱氢酶(LDH)(r=0.4789,P<0.01)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)(r=0.246,P<0.05),脂肪酶(LPS)(r=0.2357,P<0.05)以及白细胞总数(WBC)(r=0.4007,P<0.05)均呈线性相关。ROC曲线分析,s B7-H2对判断中度以上胰腺炎敏感度77.8%,特异度80.0%;判断SAP,敏感度为92.0%,特异度为86.0%。结论 AP和健康人体内存在不同水平的s B7-H2;s B7-H2对AP严重程度鉴别有重要临床价值,具有较好的敏感度、特异度,在AP诊断中具有潜在临床应用价值。

可溶性和膜型B7-H3在类风湿关节炎患者外周血中的表达及临床意义

本实验通过检测类风湿关节炎(RA)患者外周血中可溶性B7-H3(sB7-H3)和膜型B7-H3(mB7-H3)的表达及异构体的分布,探讨该分子的异常表达在RA发病中的临床意义。通过收集RA早期患者和健康对照外周血,ELISA方法检测血清中sB7-H3的表达,统计学分析sB7-H3的表达与临床的相关性;同时分离RA患者和健康对照外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclear cells,PBMC),通过流式细胞术检测CD14+的单核细胞膜型B7-H3的变化;通过PCR检测外周血mRNA水平B7-H3两种异构体的表达。结果显示RA患者血清中的sB7-H3分子明显低于健康对照组,RA活动期患者sB7-H3明显低于缓解期患者,并与RA患者肿胀关节数呈负相关;RA患者外周血单核细胞上mB7-H3的表达明显高于健康对照者,RA患者PBMC在mRNA水平B7-H3明显高于健康对照者,主要表达形式为4IgB7-H3。本研究发现膜型和可溶性B7-H3在类风湿性关节炎外周血中异常表达,其可能参与了RA自身免疫性病理的调节。

非小细胞肺癌患者胸腔积液中浸润巨噬细胞趋化因子受体CX3CR1、CCR2和CCR5的表达

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)胸腔积液中巨噬细胞趋化因子受体等的表达与疾病预后的相关性。方法密度梯度离心法分离恶性胸液标本获得单个核细胞;贴壁培养后,流式细胞术检测CD68、CCR2、CCR5和CX3CR1等受体的表达,分析其与肿瘤的相关性。结果巨噬细胞占整体胸液细胞的比例以及趋化因子受体的表达在不同患者胸液标本中各有不同,并与肿瘤的严重性呈现一定的相关性。结论 NSCLC胸腔积液中巨噬细胞及其趋化因子受体的表达与疾病预后有一定的相关性。检测结果可为NSCLC的诊治提供参考资料。