氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响

目的探讨氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法自C57BL/6小鼠(6~8周)股骨分离、培养得到BMSCs,取第3代细胞采用流式细胞术分析干细胞表面标志物。用氟终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L的培养基培养BMSCs,检测不同浓度氟对BMSCs细胞增殖(CCK8法)、凋亡(流式细胞术分析)、成骨分化能力[茜素红及碱性磷酸酶(ALP)染色]的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白[聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)]、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路成员蛋白[细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2),c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38及磷酸化ERK、JNK、p38(p-ERK、p-JNK、p-p38)],成骨分化相关蛋白[Runt相关转录因子2(Runx2)、ALP]与Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路成员蛋白[糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)及β-catenin]的表达水平;并采用免疫荧光染色分析p-GSK3β及β-catenin的表达情况;使用SP600125及DKK-1分别阻断MAPK和Wnt/β-catenin 2个信号通路后,分析细胞凋亡及成骨分化等的变化。结果成功分离、培养出小鼠BMSCs,流式细胞术分析显示,间充质干细胞表面标志分子CD73、CD90、CD105均呈阳性。各浓度组3个时间点(24、48、72 h)细胞增殖情况比较差异均有统计学意义(F=65.36、160.04、365.32,P均<0.001),各浓度组细胞早期凋亡情况(24 h)比较差异有统计学意义(F=214.04,P<0.001);与0.0 mg/L氟浓度组比较,15.0、20.0、40.0 mg/L氟浓度组细胞增殖水平均降低,10.0、15.0、20.0 mg/L氟浓度组细胞早期凋亡率均增高(P均<0.05)。15.0 mg/L氟处理细胞0~24 h,p-JNK/JNK比例在2、4、8、12、18、24 h时间点均高于0 min(P均<0.05);与单独氟处理组(15.0 mg/L)比较,SP600125阻断后细胞早期凋亡率降低(P<0.05),PARP及p-JNK蛋白表达水平均降低(P均<0.05)。成骨诱导后,与0.0 mg/L氟浓度组比较,0.1、1.0 mg/L氟浓度组ALP染色增强、矿化结节数量增多;且0.1、1.0 mg/L氟浓度组Runx2及ALP蛋白表达水平均较高(P均<0.05)。成骨诱导后,与0.0 mg/L氟浓度组比较,0.1、1.0 mg/L氟浓度组p-GSK3β/GSK3β比例及β-catenin蛋白表达水平均较高(P均<0.05);与单独氟处理组(1.0 mg/L)比较,DKK-1阻断后p-GSK3β及β-catenin蛋白表达水平均较低(P均<0.05),β-catenin入核减少,ALP染色减弱,矿化结节数目减少。结论高浓度氟(>10.0 mg/L)抑制BMSCs增殖、促进凋亡,而低浓度氟(0.1、1.0 mg/L)促进细胞成骨分化。MAPK/JNK通路与Wnt经典通路分别参与了上述细胞过程。