ROS/JNK/caspase 3信号轴在薄荷味电子烟烟液诱导牙周膜干细胞凋亡中的作用

目的:探讨薄荷味电子烟暴露对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的细胞毒性及促凋亡机制。方法:自正畸拔除的健康前磨牙的牙周膜中分离、培养得到PDLSCs,取第3代细胞,流式细胞术分析表面干细胞标志物。将薄荷味电子烟烟液(尼古丁浓度为59 mg/mL)加入细胞培养基,使各暴露剂量组细胞培养基中的尼古丁终浓度分别为0.1μg/mL、1.0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL,0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.5 mg/mL,于不同时间点(24、48、72 h)检测各组细胞的细胞活力(CCK8法)及细胞凋亡情况(7-AAD及Annexin V双染后流式细胞术分析、TUNNEL分析)。采用荧光探针DCFH-DA检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,共聚焦显微镜下观察及流式细胞分析。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)分析ROS/JNK/caspase 3信号轴相关蛋白[c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、c-Jun、磷酸化c-Jun(p-Jun)、Bcl-2、Bax和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase 3)]的表达水平,采用免疫荧光染色分析p-JNK的表达。分别添加ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(Nacetyl-l-cysteine, NAC)及MAPK/JNK特异性阻断剂SP600125预处理细胞,分析其对电子烟诱导的细胞凋亡的影响。采用Graph Pad 5.0软件包对数据进行统计学分析。结果:成功分离、培养出hPDLSCs,流式细胞术分析显示间充质干细胞表面标志分子CD29、CD90、CD105及CD146表达阳性。各电子烟暴露剂量组3个时间点(24、48、72 h)细胞活力情况相比,差异有统计学意义(P<0.001);各浓度组细胞凋亡情况相比,差异有统计学意义(P<0.001)。与0.0 mg/L浓度对照组相比,≥50μg/mL暴露剂量组呈浓度依赖性方式显著抑制细胞活力,促进细胞凋亡比例增加,并且上调细胞ROS水平。Western印迹分析提示,电子烟暴露可浓度依赖并以时间依赖激活MAPK/JNK磷酸化,NAC及SP60025预处理能反转电子烟暴露导致的上调的p-JNK及活化型caspase 3水平,降低电子烟暴露诱导的PDLSCs凋亡率。结论:ROS/JNK/caspase 3信号轴参与薄荷味电子烟暴露诱导的PDLSCs细胞凋亡。