神经肿瘤分子外科治疗的临床前及临床研究

微创外科治疗神经肿瘤既要最大程度保护神经不受损害,又要彻底或相对彻底清除肿瘤。这是20世纪末刚发展起来的以高科技为基础的新领域,已经建立的手术平台有锁孔(Keyhole)显微、神经导航和神经内镜等,对于良性肿瘤是以肿瘤组织与正常组织为界面的清除肿瘤;对于无法找到界面、呈浸润性生长的神经胶质瘤还应辅于针对肿瘤发生、发展的分子进行治疗。我国的微创神经外科治疗相对滞后,仅有少数单位已经起步,多数单位尚处在准备阶段,期望本刊特约的专家笔谈对推动我国微创神经外科发展有所裨益。

体外培养的人源神经干-祖细胞超微结构分析

目的研究神经干细胞的超微结构。方法利用无血清培养技术从人胚脑组织中分离培养神经干-祖细胞,扫描及透射电镜观察单个神经干-祖细胞及神经球的超微结构。结果所得神经干-祖细胞体外培养呈典型的神经球样生长。神经球内部由细胞以及无定形结构的物质构成,根据电子密度的不同可分明细胞和暗细胞。相邻细胞间存在细胞连接,部分相邻细胞间以及连接处的胞膜内侧可见小囊泡样结构,部分相邻细胞间还可见胞膜融合。扫描电镜下可见单个神经干-祖细胞呈球形,表面不光滑。透射电镜下可见神经干-祖细胞胞核大,胞质少,核质比高,多种细胞器不发达,多数细胞中自噬小体多见。神经干-祖细胞间存在明显的异质性,包括高尔基复合体、核糖体、溶酶体、神经微丝及微管等在不同神经干-祖细胞中的含量和分布均不一致。单个细胞的细胞核多呈球形,也可见肾形和分叶状,而神经球中细胞核欠规则。神经干-祖细胞常染色质多,异染色质少;单个核仁多见,两个或以上核仁罕见。结论人胚胎来源的神经干-祖细胞及神经球超微结构中见到的自噬小体、相邻细胞间以及相邻处的胞膜内侧的小囊泡样结构、相邻细胞间的胞膜融合现象,可为研究脑肿瘤干细胞的超微结构奠定基础。

神经干细胞延伸于脑肿瘤干细胞的研究

1992年Reynolds首先成功地从成年小鼠纹状体中分离出神经干细胞（neural stem cells，NSCs）；1997年Mckay确立了神经干细胞能提供大量脑组织所需要的功能细胞的概念；2001年Reya提出了肿瘤干细胞理论：Singh等在人脑胶质瘤组织中分离出神经干细胞样的肿瘤干细胞，并进一步证明后者可直接生成肿瘤细胞，目前称之为脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cells，BTSCs），由此开创了神经干细胞研究的新领域。

胶质瘤治疗的靶分子CDC2RNA干扰的体外实验研究

目的探讨抑制细胞周期依赖性激酶CDC2基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响．并为其作为胶质瘤发生发展相关基因在胶质瘤治疗方面的应用价值提供实验依据。方法利用本实验室基因重组构建的CDC2shRNA逆转录病毒表达质粒对体外培养的人脑胶质瘤细胞进行转染。倒置显微镜观察细胞形态和数量变化；RT-PCR及荧光实时定量PCR检测CDC2mRNA表达：Westemblot检测CDC2蛋白表达；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化；透射电子显微镜观察细胞超微结构。结果人脑胶质瘤细胞系U251在转染针对CDC2的shRNA逆转录病毒表达质粒48h后，贴壁生长的细胞逐渐漂浮，细胞生长受到抑制，CDC2mRNA下调均达98％以上．蛋白表达下调达92％以上，同时出现了明显的细胞G2／M期阻滞．细胞凋亡由0．57％上升到13．01％．并且超微结构受损明显。结论CDC2shRNA逆转录病毒表达质粒介导的RNA干扰能有效的抑制U251细胞的增殖．CDC2可作为胶质瘤基因治疗靶分子作进一步研究。

高侵袭和EGFR过表达的人脑胶质瘤组织异种原位移植模型

目的建立能向脑组织侵袭和过表达表皮生长因子受体（EGFR）的人脑胶质瘤裸小鼠原位移植模型。方法首先将体外培养高表达EGFR的人脑多形性胶质母细胞瘤细胞行裸小鼠右尾状核接种，继而将致瘤的组织块行鼠到鼠的原位传代接种。结果鼠－鼠原位传代接种至13代，生存期为（19±1．33）d。移植瘤病理符合高侵袭、高表达EGFR的多形性胶质母细胞瘤。肿瘤增殖潜伏期短于3d，快速增殖期长于15d，晚期短于3d。结论肿瘤组织块接种比单细胞悬液接种、非但接种的细胞量大，还能将支持肿瘤细胞增殖的间质成分一并植入，有利于移植瘤保持亲本肿瘤的高侵袭、高表达EGFR的特征。

脑肿瘤干细胞体外分化过程中的回逆现象分析

目的探讨脑肿瘤干细胞(BTSCs)体外分化过程中的回逆现象,为研究其分化抑制机制奠定基础。方法利用CD133免疫磁珠筛选系统,从肿瘤组织中分离获得的CD133^-细胞(BTSCs)分成4组进行培养:(1)含10%胎牛血清(FCS);(2)10%FCS+丙戊酸钠注射液(VPA);(3)无FCS+生长因子;(4)无FCS+生长因子+VPA。取不同时间点上的细胞,相差显微镜观察其形态变化;流式细胞术检测与分化相关的标志物、细胞周期和DNA倍体变化:利用免疫激光共聚焦分析与分化相关标志物的共表达情况。结果无FCS条件下培养的BTSCs呈悬浮球状生长,高表达CD133和巢蛋白(nestin),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)。G0/G1期细胞占大多数,G2/M期细胞接近0%,DNA都是异倍体,对VPA反应不敏感。含FCS培养的原本悬浮的细胞约4h开始贴壁,均呈圆形。此后逐渐向多形性分化,至7d时分化的细胞部分又返回至圆形,至10 d～21d时,有的还能重新恢复球形,并呈悬浮生长。培养3d、7d、10d和21d时,CD133、nestin阳性细胞数先降后升,GFAP^+和β-TubulinⅢ^-细胞数始终处于较低水平。含FCS培养液中加入VPA,细胞形态上未见上述的回逆现象,CD133和nestin表达的先降后升现象消失,GFAP和β-TubulinⅢ在第7天以后表达明显升高,但极大部分细胞共表达nestin。而神经干细胞(NSCs)在含FCS培养至10 d时,即以GFAP和β-TubulinⅢ表达为主,未见CD133^+细胞。此外,含血清培养时BTSCs仍以异倍体为主,含少量的G2/M期细胞,加VPA诱导后细胞周期和DNA倍体变化不明显。结论BTSCs在含血清条件下培养出现的多向分化表型不稳定,时有去分化所导致的回逆。加入诱导分化剂VPA培养,虽然能阻止回逆现象出现,并有代表星形胶质细胞和神经元标志物表达上升,但因其共表达nestin而仍属于未完全分化细胞,表明BTSCs分化始终处于受抑状态。

胶质瘤组织中SV40TagRb和IRS-1蛋白的表达及其与胶质瘤发生发展的关系

目的探讨SV40Tag、Rb和IRS-1在胶质瘤发生发展过程中的关系和作用。方法构建布有人脑胶质瘤和脑膜瘤临床标本为主体、配有实验性胶质瘤、正常人或鼠脑等相关组织等118个阵列的组织芯片，采用免疫组织化学和免疫荧光共聚焦技术检测SV40Tag、Rb和IRS-1的表达及SV40Tag与Rb、SV40Tag与IRS-1的联合表达。结果SV40Tag、Rb和IRS-1在胶质瘤和脑膜瘤中均有表达，82例胶质瘤的阳性表达率分别为65．9％、64．6％和48．8％。正常人脑组织仅有Rb和IRS-1表达，而未见SV40Tag表达。SV40Tag和IRS-1的阳性表达率与病理分级呈正相关（P〈0．05），Rb蛋白的阳性表达率与病理分级呈负相关（P〈0．05）。在82例胶质瘤中，SV40Tag与Rb、SV40Tag与IRS-1联合表达阳性率分别为51．2％和40．2％。结论外源性SV40Tag随SV40病毒侵入机体，与Rb抑癌基因形成复合物使其抑癌功能丧失，同时诱导信号通路中重要成员IRS-1活化，从而促进细胞恶性变化，可能是脑胶质瘤发生发展的重要原因之一。

人脑肿瘤组织块裸小鼠原位移植方法研究及移植瘤的亲本特征分析

目的用肿瘤组织块直接接种法建立人脑肿瘤裸小鼠原位移植模型，通过分析移植瘤的生物学特征来证明本操作方法的可行性。方法取人肺腺癌脑转移瘤的新鲜组织或人脑多形性胶质母细胞瘤（GBM）裸小鼠皮下移植瘤组织，剪成小块，置入专用套管针，通过事先钻好的颅骨孔．徒手推入裸小鼠右尾状核。观察致瘤率、移植瘤的组织细胞形态、相关标志物、MRI图像特征和荷瘤鼠生存期。结果肺腺癌脑转移瘤和GBM组织在鼠与鼠之间分别传了6代和13代，荷瘤鼠生存期分别为（38．0±0．9）d和（19．0±1．3）d。肺腺癌脑转移瘤移植瘤不向周围正常鼠脑组织侵袭，分泌酸性粘液及表达癌胚抗原等生物学特征与其亲本肿瘤一致：而GBM移植瘤具有向周围正常鼠脑组织高度侵袭及高表达表皮生长因子受体的生物学特征也与其亲本肿瘤一致。结论肿瘤组织块直接注入裸小鼠脑内建立的实验动物模型比肿瘤细胞悬液接种方法相对简易，且移植瘤能更好地保持亲本肿瘤的特征。此法可进一步在各种脑肿瘤动物原位移植实验中推广应用。

胶质瘤干细胞研究的现状与未来

脑肿瘤（主要是胶质瘤）干细胞（brain tumor stem cells，BTSCs）的研究始于2002年Ignatova等的研究，当时称神经干细胞样的细胞（neural stem—like cells）。Singh等于2003、2004年通过体内外系统实验证明，这类细胞是直接生成肿瘤细胞的细胞，称癌干细胞（cancer stem cells），也有学者称脑肿瘤始动细胞（brain tumor initiating cells），

ABCG2与VEGF、VEGFR和CD34在胶质瘤组织芯片中的共表达

目的探讨ABCG2在胶质瘤血管形成过程中与VEGF、VEGFR和CD34的关系和共表达。方法构建布有90例各级别人脑胶质瘤的组织芯片，用EnVision法的免疫组织化学染色，分别分析ABCG2、VEGF、VEGFR和CD34在胶质瘤中的表达率、微血管密度（MVD）及其相关性，并以免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜检测CD34和ABCG2共表达的细胞。结果ABCG2、VEGF、VEGFR和CD34的表达率均随胶质瘤恶性程度增加而增高；并且ABCG2表达水平与肿瘤MVD显著相关，y=0.540，P〈0.001。ABCG2阳性表达的Ⅲ、Ⅳ级肿瘤标本MVD比I、Ⅱ级高。VEGF、VEGFR和ABCG2均为阳性表达的肿瘤标本MVD平均值显著高于ABCG2阴性表达者，P〈0.001。在CD34显示的肿瘤血管腔壁上同时见到了ABCG2的表达。结论胶质瘤的恶性进展除了与公认的肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞共表达的VEGF和VEGFR高表达相关，还与ABCG2高表达相关。在同一根血管上同时见到了ABCG2（肿瘤干细胞标志蛋白）和CD34（内皮细胞标志蛋白）的共表达，表明肿瘤干细胞除了生成肿瘤细胞，还有可能生成肿瘤血管内皮细胞。