CRISPR/Cas基因组编辑技术在丝状真菌次级代谢产物合成中的应用

丝状真菌能够合成抗生素、色素、酶制剂、激素等多种天然产物,广泛应用于医药、化工、农业和基础生物学研究等领域。丝状真菌遗传背景复杂,阻碍了对其的进一步开发利用。基因组编辑是基于核酸酶对基因组位点特异性序列进行靶向切割,产生双链断裂,从而通过非同源末端连接或同源重组进行修复的技术。其中,CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是目前使用最普遍的基因组编辑技术,已在丝状真菌遗传育种、基因改造和多种天然产物合成等方面进行了大量应用。本文总结了丝状真菌CRISPR/Cas的技术原理、元件表达、递送方式及该系统在次级代谢产物等研究中的应用。对于脱靶效应以及转化率低的问题,本文讨论了可能的解决方法。在此基础上,展望了基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术在真菌基因功能表征、天然产物合成代谢途径解析与重构、高效丝状真菌底盘细胞构建、天然产物合成等方面的应用。

基于KRAS蛋白结构的药学研究——生物化学课程教育教学改革研究与实践

目的:本项目通过将生物化学领域里的结构生物学知识应用于药学研究,拓展了基于结构的药物分子分析与设计的理论与技术。通过对药物靶点蛋白结构的统计与分析,研究了KRAS相关蛋白质结构与功能之间的关系,以及药物分子靶向目标蛋白质的分子机制,完成其结构与功能之间关系的分析,指导化合物的合成,为新药设计奠定基础。方法:主要通过PDB、PDBePISA、UniProt等数据库和网络服务器以及Chem3D、UCSF Chimera、PyMol、Origin等软件对于KRAS相关蛋白质的一系列重要参数进行检索、计算和绘图等,收集、整理、分析KRAS蛋白质分子的结构域功能信息,研究药物分子靶向目标蛋白质的分子机制。结果:KRAS蛋白与其配体化合物的结合面积与化合物的分子量呈正相关(除少部分外)。此外,KRAS蛋白与其配体化合物的结合为非共价结合时,化合物的摩尔折射率和分配系数都对其理论结合能影响不大,几乎维持在−5 kcal/mol到5 kcal/mol之间,而且配体化合物通常结合在Switch-II Pocket (S-IIP)附近。而当KRAS蛋白与其配体化合物的结合为共价结合时,突变体的结合能几乎都为负值,绝对值显著增大,而非突变体的结合能变化不大,依旧维持在−5 kcal/mol到5 kcal/mol之间,且配体化合物往往结合于第12位的甘氨酸突变产生的半胱氨酸附近。结论:靶向KRAS的药物分子若能够与蛋白质中由第12位的甘氨酸突变产生的半胱氨酸形成共价结合,且分子量较大,则其与蛋白质的结合面积相对较大、结合较为牢固、特异性更强,或者药物分子可以以非共价结合的方式结合于S-IIP附近,可以增强对KRAS的抑制效应。

研究生实践与规划创新综合能力培养提升教育研究

研究生培养是高等教育体系中非常重要的部分,在国内外高等学府中都受到高度重视。研究生培养的主要目标之一是专业综合能力的提升,这些综合能力包含以下几个相互关联的重要方面:专业技术领域的动手实践能力;在明晰原理与因果关系的基础上分清先后顺序与步骤,设计规划解决问题的能力;用科学语言准确客观再现操作过程、用科学方法呈现原始实验数据的能力;准确分析实验现象、分清主次查找关键原因、辨别假象、正确客观解读实验结果的能力。以自然科学领域研究生为例,从前两个方面来探讨研究生培养的改进方式。

R-依福地平单晶的制备和结构表征

依福地平外消旋体采用丙酮重结晶,加热溶解澄清后,室温避光静置可顺利获得标题化合物,该纯光学异构体结构经单晶衍射表征。晶胞参数a=9.957 1(3),b=13.187 9(3),c=24.611 7(7),α=β=γ=90°,正交晶系,P2_12_12_1手性空间群,绝对构型参数-0.04(2)。

依折麦布-烟酰胺共晶制备、表征与溶出度

采用固态研磨法,以依折麦布和烟酰胺为原料,少量醇作溶剂,球磨机研磨,得到目标化合物.该共晶体结构采用X射线粉末衍射法(PXRD)、差式扫描量热法分析联用(DSC)、红外光谱(IR)和扫描电镜(SEM)进行了表征.进一步的溶解度和溶出度测定证明该新的依折麦布-烟酰胺共晶较依折麦布具有显著的提高.

盐酸丁卡因多晶型制备和溶解度测定与关联

盐酸丁卡因具有多晶型现象,晶型药物溶解度的测定是目前药物质量控制研究领域的热点问题,商品化盐酸丁卡因溶解度的测定未见文献报道,故对其溶解度进行测定与关联研究。在定性定量分析盐酸丁卡因多晶型现象的基础上,采用平衡法测定了商品化盐酸丁卡因原料药在纯溶剂及混合溶剂中的溶解度。研究表明,盐酸丁卡因在甲醇-乙酸乙酯混合溶剂中存在着潜溶现象,当甲醇摩尔分数为0.8492时,溶解度达到最大值。在纯溶剂中,盐酸丁卡因的溶解度数据符合Apelblat方程;在混合溶剂中,盐酸丁卡因的溶解度数据符合CNIBS/R-K方程,拟合结果与实验数据的相关系数R 2大于0.99。利用van′t Hoff方程计算得到盐酸丁卡因在溶解过程中的溶解熵和溶解焓,证实其溶解过程是吸热和熵驱动的。

拉米地坦关键中间体合成工艺改进

以2-溴-6-(1-甲基哌啶-4-基羰基)吡啶为原料,微量氧化亚铜为催化剂,氨水为氨源,在常压和80~90℃条件下反应4 h,可制得2-氨基-6-(1-甲基哌啶-4-基羰基)吡啶,经与盐酸成盐后获得拉米地坦合成的关键中间体2-氨基-6-(1-甲基哌啶-4-基羰基)吡啶双盐酸盐。该方法采用氨水替代高危试剂液氨,规避了高压条件,收率可达70%,产品HPLC纯度可达98%以上。其合成工艺具有反应条件温和,操作简便易行,不需要高压设备,符合绿色化学理念,适合规模化制备的优点。

丁葵草提取物对小鼠急性炎症抑制作用的研究

通过二甲苯致小鼠耳肿胀试验、角叉菜胶致小鼠足肿胀试验、腹腔毛细血管通透性抑制率的测定及足肿胀部位病理学的分析,探讨丁葵草提取物对急性炎症的作用。结果表明,丁葵草高(20 g·kg^(-1))、中剂量(6.6 g·kg^(-1))组可不同程度抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀及角叉菜胶所致的足肿胀作用,降低毛细血管的通透性,减轻足肿胀部位病理学炎症改变及炎症部位前列腺素E_2(PGE_2)渗出。丁葵草具有良好的抗急性炎症作用,其抗炎机制可能与抑制炎症部位PGE_2的产生有关。

2-甲氧基雌二醇氯仿溶剂化物脱溶剂动力学研究

在2-甲氧基雌二醇氯仿溶剂化物(2-ME.2CHCl3)制备和单晶X-射线衍射法进行结构确证的基础上,采用等温脱溶剂法和非等温脱溶剂法,进行2-ME.2CHCl3脱溶剂动力学规律研究.2-ME.2CHCl3等温脱溶剂过程的脱溶剂机理最适模型为R3,即几何边界层模型;其非等温脱溶剂过程的脱溶剂机理,在升温速率为5 K/min以下时,最适合模型为R3,在升温速率为10 K/min^20 K/min时,最适合模型为R2,属于相界面反应机理,控制步骤是相界面的推进.2-ME为进入临床研究的具有抗肿瘤作用的药物,其溶剂化物脱溶剂动力学研究,可以为其制剂研究提供重要的依据.

普瑞巴林晶型Ⅰ在纯溶剂及丙酮-水混合溶剂中的溶解度测定与关联

通过平衡法测定了283.15~328.15 K温度下普瑞巴林晶型I在水、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯及丙酮-水混合溶剂中的溶解度,实验结果表明:普瑞巴林晶型I在所测定的所有纯溶剂及丙酮-水混合溶剂中的溶解度均随温度的升高而增大;在丙酮-水混合溶剂中,溶解度随着丙酮的摩尔分数的增加而降低,在丙酮的摩尔分数达到0.83附近时溶解度最小,接近0。采用修订的Apelblat经验方程和(CNIBS)/Redlich-Kister方程对溶解度数据进行关联,结果令人满意。所得实验数据和拟合模型为普瑞巴林在工业结晶及药物多晶型等方面的研究提供了重要的依据。

基于TG-DSC联用法的腺苷钴胺热分解机制研究

目的研究腺苷钴胺原料药的热分解规律,为其稳定性研究提供理论依据。方法在采用X-PRD,IR和HPLC法对腺苷钴胺检测样品进行定性和定量分析的基础上,对相同粒度样品和不同粒度的样品进行TG-DSC检测,分析失重、峰形和峰值特征,得到腺苷钴胺热分解的规律,并讨论其影响因素。结果首次提出腺苷钴胺二次失水的热分解机制,即腺苷钴胺在64℃~83℃发生一次脱水,在206℃附近发生二次脱水,在276℃发生完全分解。结论该研究结果为腺苷钴胺原料药质量控制的开展提供了重要的理论研究依据。

环境未培养微生物中新型抗生素的发掘研究进展

抗生素耐药基因的快速扩散和传播导致现有抗生素对耐药致病菌的疗效降低甚至失效,因此迫切需要开发新型抗生素。然而,利用经典的筛选可培养微生物的方法已难以获得新型抗生素。同时,新型抗生素的发掘不仅能为对抗耐药致病菌提供解决方案,还能为挖掘其他天然产物并构建微生物细胞工厂提供理论依据和实践指导。微生物组学和合成生物学的发展为新型抗生素发现提供了新的思路。本文对应用微生物组学解析多种环境未培养微生物及其抗生素合成基因,挖掘特定环境中的新型抗生素合成基因簇,利用合成生物学设计、构建、测试和学习的循环方法在模式微生物中表征新型抗生素合成基因簇等方面的研究进展进行了综述,并进一步展望了微生物组学和合成生物学在新型抗生素发掘方面的作用。

沙库巴曲沙坦类药-药共晶研究进展

开发新型药-药共晶的临床应用价值是值得期待的研究领域。近年来,多个药-药共晶药物获得美国和我国药品审评中心上市批准,这使得药-药共晶药物研究成为药物晶型领域的研究热点,药-药共晶成为多靶点药物开发的新思路。沙库巴曲可与多种沙坦类药物在分子水平上形成药-药共晶,该文对沙库巴曲-沙坦类药物共晶的作用机制、结构特征和制备方法等发展情况进行综述。

金花葵对小鼠急性炎症的抑制作用研究

为了研究金花葵的抗炎作用,试验采用腹腔注射6mL/L醋酸致小鼠腹腔染料渗出法、二甲苯致小鼠耳片肿胀和角叉菜胶致小鼠足肿胀模型,通过灌胃或局部涂抹金花葵提取物,观察金花葵对急性炎症的抑制作用。结果显示,金花葵可以有效抑制急性炎症部位毛细血管通透性的增加,减少炎性细胞渗出和水肿的发生,有效降低组织肿胀率,说明金花葵对急性炎症的发生有明显抑制作用。

依福地平中间体的合成工艺改进

以N-苄基苯胺为原料,经亲核取代、酯胺交换和氨基取代3步反应得到依福地平关键中间体3-氨基-2-丁烯酸-2-(N-苄基-N-苯基)氨基乙酯(氨基片段)。酯交换一步采用碱性催化剂替代原工艺中酸性催化剂;氨基取代一步添加ZSM-5分子筛催化,并采用不锈钢曝气头取代原工艺中导气管。新工艺缩短了反应的时间,降低了氨气的用量,提高了反应收率。改进后的工艺,总收率提高至72.4%,较原工艺提高了9.0%,生产成本降低,操作简便易行,适合工业化生产。

腺苷钴胺有关物质与流动相pH值相关性研究

采用HPLC法,在现行版药典的研究方法基础上,仅改变流动相pH值,进行腺苷钴胺有关物质变化规律研究,获得腺苷钴胺有关物质与流动相pH值的相关性研究结果.结果显示,腺苷钴胺有关物质含量在pH值为2.9时最低,偏离这个pH值后,有关物质含量呈现明显的增加趋势.流动相pH值的控制是腺苷钴胺有关物质分析的关键因素,该研究结果为腺苷钴胺原料药杂质谱控制提供重要的研究依据.

济源冬凌草甲素衍生物作为潜在抗肿瘤药物的合成及药理学活性研究

济源冬凌草甲素(JOA)是从河南省济源市收集的冬凌草中纯化得到的二萜类成分,表现出多种抗肿瘤活性.为了进一步研究JOA的药用效果,设计合成了一系列其14-OH苯甲酸衍生物,随后评估了它们的体外抗增殖活性.结果证明,该系列衍生物的抗肿瘤活性优于先导化合物JOA及冬凌草甲素.其中,7α,20-内酯-对映-贝壳杉-16-烯-11,15二酮-14β-(2-硝基-5-氯苯甲酸)酯(OJW8-9)的活性最好[对SW1990细胞的IC_(50)=(0.478±0.109)μmol/L].进一步的作用机制研究表明,化合物OJW8-9通过阻断处于G2/M期的SW-1990来抑制细胞增殖,且具有浓度依赖性,其可能通过活性氧(ROS)途径诱导细胞凋亡.

tRNA修饰酶TiaS蛋白结构与功能研究及其锌指的潜在应用

含有锌指的TiaS (tRNAIle2 agmatidine synthetase)蛋白是来自古菌的酶,具有四个结构域,功能是利用ATP水解释放的能量在tRNAIle2反密码子CAU的简并碱基胞嘧啶Cyt34的2’碳原子上面加上胍基丁胺Agmatine修饰,从而让tRNAIle2成熟不识别AUG,而正确识别AUA密码子。单独TiaS蛋白,TiaS蛋白与tRNA复合物结构已经解析,酶催化修饰的分子机制获得了较深入解读。生化实验表明,TiaS蛋白N端三个结构域具有催化活性,TiaS为焦磷酸酶,可以水解ATP。并且TiaS蛋白的N端结构域可以起到激酶的作用,自磷酸化Thr18氨基酸残基。C端锌指距离酶核心较远,对于识别结合底物具有重要作用。本文总结TiaS蛋白研究进展。对于TiaS蛋白的深入研究,将为深入理解酶催化机制,为酶的工程改造,为锌指的工程改造开辟思路。包括锌指与CRISPR/Cas在内的靶向核酸元件在生命医药和研究领域有广泛应用,TiaS蛋白锌指结构新特性的研究也为基于锌指的靶向核酸组件设计打下基础。

SHP2调节剂在肿瘤免疫治疗中的研究进展

Src同源酪氨酸磷酸酶2(Src homology phosphotyrosyl phosphatase 2,SHP2)是由PTPN11编码的蛋白酪氨酸磷酸酶,可催化蛋白酪氨酸位点的去磷酸化。作为汇聚节点,SHP2介导鼠肉瘤(rat sarcoma,RAS)-快速加速纤维肉瘤(rapidly accelerated fibrosarcoma,RAF)-丝裂原活化细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)-细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)、Janus激酶(janus kinase,JAK)-信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)和程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)/程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)等多个信号通路,不仅可调控肿瘤细胞的生长增殖,还可通过影响肿瘤微环境介导肿瘤细胞的免疫逃逸,在肿瘤免疫调控中发挥双重生物学功能,是一种很有前景的肿瘤免疫治疗靶点。截止目前,已有多种SHP2变构抑制剂开展了单一或联合用药策略的肿瘤免疫治疗临床研究,此外SHP2激活剂也在肿瘤免疫调控领域呈现出治疗潜力。本文综述了SHP2在肿瘤细胞和免疫细胞中的双重肿瘤免疫调控功能,概述了目前SHP2调节剂在肿瘤免疫治疗领域的最新研究进展,并对该领域的研究挑战和应用前景进行了讨论和展望,旨在开拓SHP2调节剂在肿瘤免疫治疗领域的新视野。

2-苯基环丙胺类衍生物合成研究进展

2-苯基环丙胺及其衍生物是合成抗肿瘤药、抗抑郁药和抗凝血药等的重要手性中间体。其合成途径主要包括由环丙烷类衍生物直接合成和从头构建环丙烷策略(如Corey-Chaykovsky反应、Kulinkovich-de Meijere反应等)。文章对2-苯基环丙胺及其衍生物的合成路线进行系统总结和概括,并对各路线进行简要评述。