中药干预非酒精性脂肪性肝炎的机制研究进展

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)属于代谢综合征,已成为一个普遍关注的公共卫生问题。非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD的进展性病变,是由多种风险因素和多种组织器官平行相互作用的结果。由于NASH的潜在病理生理机制十分复杂,目前还没有获批的药物来控制疾病的发生发展。中医将NAFLD归为“肝癖”范畴,并将NASH分为肝郁脾虚、痰湿内阻、湿热蕴结及痰瘀互结4个证型。中医以其独特的理论体系和治疗策略,可以对不同NASH症型进行有效干预和治疗。随着现代药理学和分子生物学的不断发展,越来越多的研究表明中药复方和单味中药活性成分通过多种机制改善NASH,从而推进了中医药的应用。为此该文分别从中药复方和单味中药活性成分这两方面重点论述了中药改善NASH的相关机制,以期为合理有效治疗NASH提供理论和实验研究依据。

药物安全性评价研究中的大鼠骨髓涂片的评价

骨髓涂片评价是对造血系统评价的重要方法。大鼠为常用的研究用实验动物,而且常常进行骨髓涂片评价。现对大鼠骨髓涂片的评价进行综述,旨在为药物的安全性评价的骨髓涂片评价提供参考。

石松生物碱研究进展

本文综述了自1994年以来天然石松生物碱的研究进展和石杉碱甲的抗乙酰胆酯酶生物活性及它的构效关系研究。按照石松生物碱的分类方法,系统归纳了lycopodine,lycodine,fawcettimine和misceualleous四种类型生物碱的结构特点和内在的相互关系,以及各种类型的新天然化合物。石杉碱甲是由我国科学家首先发现的一个天然的石松生物碱,药理实验证明它是一个高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,具有口服生物利用度高、作用时间长、副反应小的特点,优于已上市的第一代治疗老年痴呆药物E2020,Tacrine,Physostigmine和Gslanthamine。已合成的大量的石杉碱甲类似物的药理实验表明,作为AChE抑制剂,石杉碱甲是一个紧凑的结构,现有的结构要素一个都不能少。不过,以天然石杉碱甲为原料合成的席夫碱衍生物和用石杉碱甲的结构片断与Tacrine相结合的类似物研究取得了可喜的进展。

BCR-ABL与泛素E3连接酶c-CBL的相互作用在慢性髓系白血病靶向治疗中的作用及相关机制研究

目的:通过对BCR-ABL与泛素E3连接酶c-CBL的相互作用结构域的筛查,明确砷剂治疗慢性髓系白血病(CML)的结构基础。方法:根据BCR-ABL与c-CBL的结构信息,对二者的结合界面进行结构模拟与分析,基于此构建BCR-ABL的不同突变体[(△SH2(Src同源结构域2)、△TyrKC(酪氨酸激酶催化结构域)和△SH2/TyrKC(S/H))以及c-CBL的突变体△RF(环指结构域),转染293T及HeLa细胞,应用免疫共沉淀(Co-IP)]及免疫荧光(IF)共定位的方法筛查BCR-ABL与c-CBL的相互作用结构域。结果:Co-IP发现BCR-ABL的TyrKC结构域主要参与了与c-CBL的相互作用,SH2结构域也发挥一定的作用,但作用弱于TyrKC结构域;当两个结构域同时截短后,BCR-ABL与c-CBL几乎不发生相互作用;同时c-CBL的RF结构域在一定程度上影响了与BCR-ABL的相互作用。IF的结果与Co-IP相符,证明了结构模拟的准确性。结论:BCR-ABL的TyrKC和SH2结构域主要参与了与c-CBL的相互作用,而c-CBL的RF结构域参与了与BCR-ABL的相互作用。c-CBL与BCR-ABL的相互作用对BCR-ABL的稳定性发挥调控作用,对于深入理解砷剂靶向治疗CML分子机制提供了结构基础。

SPF级F344大鼠的脏器重量和自发性病变的研究

目的建立F344大鼠的背景资料，为药物安全评价的病理学评价提供基础。方法10只溶剂对照用F344大鼠．7—10周龄，体重70—200g，雌雄各半，处死后解剖，称量脑、心、肝、脾、肾、肾上腺、胸腺、睾丸或子宫和卵巢的绝对重量并计算相对体重和脑重的相对重量，并对上述称量脏器和胸骨、股骨、眼球、胃肠道、胰腺、附睾和前列腺或阴道、坐骨神经、肌肉、甲状腺进行病理检查。结果雄性大鼠的脑、心、肝、脾、肾、肾上腺、胸腺和睾丸的绝对重量分别为：1．736±0．080，0．597±0．009，5．825±0．305，0．355±0．016，1．267±0．029，0．039±0．006，0．291±0．058和2．087±0．081；对体重的相对重量分别为：1．009±0．027。0．347±0．013，3．385±0．094。0．207±0．010。0．737±0．022。0．022±0．003，0．169±0．032和1．215±0．073；对脑重的相对重量分别为：0．345±0．021，3．356±0．091，0．205±0．015，0．731±0．031，0．022±0．003。0．168±0．034和1．206±0．105。雌性大鼠的脑、心、肝、脾、肾、肾上腺、胸腺、卵巢和子宫的绝对重量分别为：1．642±0．066，0．446±0．009，3．677±0．262。0．319±0．012，0．947±0．057，0．041±0．012。0．246±0．043。0．050±0．011和0．267±0．062；对体重的相对重量分别为：1．338±0．100，0．363±0．021，2．996±0．288。0．259±0．016．0．772±0．070．0．034±0．010，0．201±0．038，0．041±0．009和0．217±0．051；对脑重的相对重量分别为：0．272±0．005。2．237±0．101。0．194±0．011，0．577±0．028，0．025±0．008。0．150±0．022。0．030±0．007和0．163±0．042。大体解剖均未见改变．病理组织学检查可见脾脏髓外造血、肝细胞空泡变性、肝脏小灶性炎、肾脏嗜碱性肾小管、肾脏皮髓交界处钙盐沉积、脾脏色素沉积、前列腺间质淋巴组织增生等自发性病变。结论在本试验条件下，10周龄内F344大鼠可出现自发性病变，但程度均较轻；其脏器重量可作为药物安全评价的病理学评价基础。

胰蛋白酶与赖氨酸C端内切酶不同顺序酶切对蛋白质组样本制备的影响

在基于质谱的蛋白质组学研究中,深度高效的蛋白质酶解是确保蛋白质被充分酶解,提升蛋白质鉴定深度(包括鉴定蛋白质数目以及蛋白质氨基酸序列覆盖率等)的关键。胰蛋白酶(trypsin)由于其能够特异性酶解精氨酸和赖氨酸羧基端,是基于质谱技术的蛋白质组学领域应用最为广泛的蛋白酶。然而,研究发现,胰蛋白酶对于赖氨酸残基的切割存在一定的遗漏酶切效率。因此,在实际蛋白质组学样本制备中,会采用胰蛋白酶和赖氨酸C端内切酶(LysC)联合使用的方式,确保赖氨酸残基的充分酶切。我们的研究发现,常用的LysC-Trypsin串联酶切的方式,会因首先加入的LysC对后续加入的胰蛋白酶进行切割,从而影响了胰蛋白酶对蛋白质样本的酶切效果。因此,本研究进行了LysC和胰蛋白酶串联酶切顺序的调整,即首先进行胰蛋白酶酶切,再加入LysC酶进行切割。本文全面比较了Trypsin-Trypsin(T-T)、LysC-Trypsin(L-T)和Trypsin-LysC(T-L)3种不同的顺序酶切方法对蛋白质样本制备质量的影响,结果表明,Trypsin-LysC顺序酶切方法在不增加实验成本的条件下,不仅获得最低的蛋白质赖氨酸/精氨酸遗漏酶切位点数目,而且酶解后得到的肽段氨基酸序列长度适中,使得Trypsin-LysC酶切后肽段样本更有利于反相色谱吸附和分离,以及串联质谱检测,从而最终显著提升样本中蛋白质的检测深度和蛋白质氨基酸序列覆盖率。本文工作为蛋白质样本的溶液内顺序酶切提供了新的技术方案和参考依据。

短期大鼠致肝癌模型肝脏线粒体损伤的研究

大鼠短期肝脏致癌模型是用来快速特异检测肝脏致癌物的试验模型,本实验使用此模型以研究癌前病变过程中肝脏线粒体的损伤情况。模型过程中,6周龄雄性SD大鼠40只随机平均分为4组,第0周,模型组大鼠按200mg/kg体重的剂量一次性腹腔注射启动剂二乙基亚硝胺(DEN)。对照组大鼠按1ml/kg体重的剂量一次腹腔注射生理盐水。第2周开始给予促癌剂2-乙酰氨基芴,按0.01%的浓度与饲料混合,给予模型组大鼠直至实验结束。第3周全部大鼠进行肝脏大部分切除术,在8周解剖。使用生化学方法检测线粒体特异性清除自由基的3个相关酶过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽还原酶(GSH-rd),超氧化物歧化酶(Mn-SOD);使用PCR方法检测线粒体DNA(mtDNA)损伤情况。模型组线粒体CAT,GSH-rd,Mn-SOD的活力较对照组有明显的下降,模型组大鼠肝脏线粒体DNA存在缺失。在模型重,模型组大鼠肝脏自由基产生过多而机体内的抗氧化防御系统不能将其消除时,可导致线粒体的氧化损伤;同时由于线粒体DNA容易受到活性氧的攻击,从而造成mtDNA的损伤。结果提示线粒体的氧化损伤及mtDNA的缺失可能癌前病变的产生相关。

天然产物药物开发中资源问题的解决方案概述

天然产物是现代药物开发中先导结构的重要来源,但是天然活性先导化合物在天然生命体中往往含量微少,这严重限制了其临床前及临床研究,难以满足其后续的市场需求。本文通过具体案例剖析,归纳总结了源于结构复杂的天然产物在药物开发中资源问题的几种有效解决方案:1寻找量丰的核心天然骨架,再经半合成制备;2寻找其量丰的生源合成前体经仿生合成制备;3由量丰天然类似物经化学转化制备;4简化先导结构再全合成制备。希望为解决复杂天然产物药物开发中的资源供应提供借鉴。

枸杞子多糖提取物LBP1C通过激活TFEB延缓衰老

目的探究枸杞子提取物LBP1C延缓人成纤维细胞及线虫自然衰老的效应及机制,以期解读《本草纲目》记载的枸杞子轻身不老、易颜色、变白的科学内涵。方法以人成纤维细胞及线虫自然衰老为模型,用LBP1C处理人成纤维细胞(复制性衰老模式细胞),检测P16、P21表达水平及β-gal染色指征衰老水平;用qPCR的方法检测转录因子GATA4及衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype,SASP)指标的mRNA水平;通过免疫荧光检测溶酶体生物发生和自噬的关键转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)入核水平,通过Western blot检测LC3II/I的水平以指征LBP1C对自噬水平的影响;在细胞及线虫体系检测LBP1C对脂褐质水平进行检测。通过线虫身体在相同时间内的摆动次数和咽部吞咽次数评估LBP1C对线虫运动能力的影响。结果LBP1C处理的人成纤维细胞组中衰老相关指标(P16、P21表达水平及β-gal染色)相比于对照组显著下降,表明LBP1C可延缓细胞衰老;LBP1C还降低了细胞及线虫的脂褐质积累,并提高线虫运动及吞咽能力,促进线虫的健康从而抑制衰老。机制上,LBP1C处理组中TFEB入核比例显著升高,激活了自噬。自噬水平的提高降低了SASP的转录因子GATA4水平,从而降低了SASP相关的IL-1β及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)水平。同时,自噬水平的提高使脂褐质降解加速,降低了细胞及线虫中脂褐质的积累。结论LBP1C通过激活TFEB提高了自噬水平,从而降低了SASP及脂褐质的积累,具有延缓衰老的效应,并促进了健康衰老。本研究初步揭示了枸杞子在抗衰老及抑制脂褐质从而潜在美白作用的效应及机制,为其进一步抗衰老和美白产品的研发提供了科学依据和理论基础。

不同亚型CHO宿主细胞对抗体表达的影响

CHO细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。其中,CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S是最常见的3种亚型。虽然这些亚型是从共同的原始CHO细胞分离出来的,但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和保存,使得CHO细胞积累了大量变异,导致宿主细胞应用于抗体药生产时会在细胞生长状态、抗体表达量及以糖型为代表的质量属性方面表现出较大差异。综述了CHO细胞不同亚型的染色体差异、生长状态、表达差异以及糖型差异,以期为抗体药物研发中宿主细胞的选择提供参考。

4种高毒有机磷化合物体外稳定性及小鼠染毒后体内活性持续时间

目的评价梭曼、沙林、塔崩和维埃克斯(VX)4种有机磷化合物的体外稳定性及小鼠染毒后毒剂分子在血液中活性持续时间,为有机磷化合物中毒救治中药物的使用频率和给药时间等提供参考和指导。方法(1)有机磷化合物体外稳定性评价。梭曼、沙林和VX分别用无菌水稀释1×105倍,塔崩用无菌水稀释1×104倍,将以上稀释好的4种有机磷化合物再分别用PBS稀释100倍后置37℃恒温培养箱孵育,分别在0,10,20,40,90,120和240 min取出一定量有机磷化合物与乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液0.2 g·L-1反应,采用Ellman法测定AChE活性,并计算酶活抑制率。(2)有机磷化合物染毒小鼠后血液分离物对AChE活性抑制作用。将4种有机磷化合物配置成不同浓度梯度后对KM小鼠进行腹部皮下染毒,以组内小鼠未出现死亡时的最高使用剂量为随后建模的动物染毒剂量,在该剂量染毒后分别于0,10,20,40,90,120和240 min取全血,采用超滤离心法分离各时间点体内残留的有机磷化合物并采用Ellman法测定其对AChE活性抑制率。结果(1)在体外稳定性实验中,各时间点梭曼的AChE活性抑制率为90%~95%,与0 min组相比无明显差异;沙林的AChE活性抑制率为20%~70%,与0 min组相比,40 min时酶活抑制率开始明显下降(P<0.05),直到240 min时急剧下降至0 min组的约50%(P<0.01);塔崩的AChE活性抑制率为5%~50%,从10 min起明显下降(P<0.05),随时间延长逐渐降低,240 min时衰减至0 min组的约10%(P<0.01);VX的AChE活性抑制率为80%~90%,整个时段酶活抑制率未见明显变化。(2)在体内实验中,确定梭曼140μg·kg^(-1)、沙林220μg·kg^(-1)、塔崩300μg·kg^(-1)和VX 14μg·kg^(-1)作为KM小鼠染毒最佳剂量。与0 min组相比,梭曼染毒40~90 min内,血液分离物对ACh E的活性抑制率显著升高(P<0.05);沙林染毒20后直到240 min,血液分离物对AChE的活性抑制率均显著升高(P<0.05,P<0.01);塔崩染毒后20 min和40 min,血液分离物对AChE的活性抑制率均显著升高(P<0.05,P<0.01);VX染毒后各时间点血液分离物对AChE活性未产生明显的抑制效果。结论梭曼和VX在体外不易降解,活性可维持较长时间,性质稳定,而塔崩和沙林易降解失活;在4种有机磷化合物中,VX致死剂量最低,毒性最大,塔崩致死剂量最高,毒性最小。在体内复杂生理环境下,梭曼、沙林、塔崩并未立即分解或全部与酶结合,其活性能在体内尤其血液循环中维持较长时间,并在较长时间内对酶产生持续抑制的效果;仅VX进入体内后迅速起效而未产生持续性抑制效果。

细胞色素P450CYP3A65斑马鱼模型建立及对环境污染物的生物响应

目的：建立细胞色素P450CYP3A65荧光标记转基因斑马鱼用于快速、直观检测重金属（铜、镉、锌）及类二噁英化合物五氯联苯（ PCB126）等环境污染物。方法 PCR方法钓取斑马鱼CYP3A65基因调控序列，构建于pT2AL200R150G转座载体克隆位点，将pTol2-CYP3A65-EGFP 质粒与pCS-TP 转座酶mRNA共同注射入斑马鱼胚胎单细胞，通过荧光筛选，遗传选育和建立荧光标记转基因斑马鱼品系 Tg （ CYP3A65-EGFP）；利用该转基因斑马鱼胚胎及幼鱼检测上述3种重金属及 PCB126的生物学响应。结果成功建立了CYP3A65荧光标记转基因斑马鱼品系，绿色荧光在肝和消化道表达；该转基因斑马鱼对3种重金属及PCB126产生生物学响应。染毒96 h后，铜0.1和0.2μmol·L^－1、镉0.35和0.7μmol·L^－1组、锌1.5和3μmol·L^－1组、PCB126所有浓度组荧光相对表达量显著增强（ P＜0.01）；铜0.9μmol·L^－1组、镉2.7和5.4μmol·L^－1组及锌24μmol·L^－1组荧光相对表达量显著减弱（ P＜0.01）；染毒168 h 后，铜0.1和0.2μmol·L^－1组、镉0.35和0.7μmol·L^－1组、锌1.5和3μmol·L^－1组及PCB1262～32μmol·L^－1浓度组荧光相对表达量显著增强（ P＜0.01），铜0.9μmol·L^－1组、镉2.7和5.4μmol·L^－1组、锌12和24μmol·L^－1组荧光相对表达量减弱（ P＜0.05），随着浓度增加荧光减弱，呈现出量效关系。结论 CYP3A65荧光标记转基因斑马鱼模型可以用来检测铜、镉、锌及PCB126等环境污染物。

低剂量全氟异丁烯致大鼠急性肺损伤及清开灵早期治疗长期效果观察

目的观察低剂量全氟异丁烯(PFIB)单次暴露诱发大鼠急性肺损伤(ALI)及清开灵注射液早期救治的长期效应。方法雄性Wistar大鼠224只,随机分为正常对照组(空气暴露后ip给予生理盐水10 m L·kg^(-1))、清开灵对照组(空气暴露后ip给予清开灵注射液10 m L·kg^(-1))、PFIB染毒组(PFIB 280 mg·m-3,染毒5 min,1 h后ip给予生理盐水10 m L·kg^(-1))和清开灵救治组(PFIB染毒后1 h ip给予清开灵注射液10 m L·kg^(-1)),分别于染毒后24 h和3,6,12,24,36和48周随机处死8只,检测动脉血气、肺功能、肺系数、支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量、肺组织和血浆中羟脯氨酸(HYP)含量等。结果与正常对照组相比,PFIB中毒组大鼠染毒后24 h肺系数和BALF中蛋白含量显著升高(P<0.01),动脉血氧分压Pa O2(P<0.01)和氧饱和度Sa O2显著降低(P<0.05),吸气时间、呼气时间、潮气量(TV)、呼气量(EV)、呼气末停顿和弛豫时间显著降低(P<0.01);上述指标从3周开始逐渐恢复至正常水平;至48周时,TV、EV和呼气峰流量(PEF)与正常对照组相比显著降低(P<0.05)。肺组织中HYP含量在染毒后24 h与正常对照组相比降低(P<0.05),之后至6周时显著高于正常对照组(P<0.05),12周后恢复至正常水平。血浆中HYP含量在染毒后24 h与正常对照组相比升高(P<0.05),之后逐渐恢复至正常水平。清开灵治疗组大鼠染毒后24 h BALF中蛋白含量显著低于PFIB中毒组(P<0.01);染毒后24 h至24周,TV、EV、吸气峰流量和PEF值与PFIB中毒组均无显著性差异,至48周时TV和EV均显著高于PFIB中毒组(P<0.05),恢复至正常对照组水平。结论低剂量PFIB致大鼠ALI的长期修复过程中,肺组织损伤得到代偿性修复,但肺容量和肺通气功能有所降低。清开灵早期救治可抑制PFIB-ALI急性期BALF中蛋白渗漏,并对后期肺功能恢复起到一定的作用。