心肌细胞NAD(P)H荧光成分分析法监测心脏移植排斥反应

目的为早期诊断和有效预防心脏移植排斥反应,研究在细胞水平用心肌NAD(P)H荧光成分分析监测排斥反应的可行性。方法用NAD(P)H荧光标记监测线粒体功能,从14例儿童心脏移植患者心内膜活检组织中分离活体心肌细胞和大鼠(n=5,13～14周龄)心肌细胞,光谱分辨的时间相关单光子计数(TCSPC)记录375nm紫外激光激发的心肌自发荧光(AF)光谱和荧光寿命。将鼠心肌细胞分为4组,无缺氧对照组,无缺氧鱼藤酮组,缺血对照组和缺血鱼藤酮组;对比无排斥反应(R0)人心肌细胞,无缺氧鼠细胞和缺血鼠细胞间,R0人心肌细胞和轻度排斥反应(R1)间的AF动力学变化。结果成功分离并测定了人心肌细胞AF光谱,在420～560nm光谱区域,至少存在0.5～0.7ns,1.9～2.4ns和9.0～15.0ns3个AF寿命池。与无缺氧对照组比较,缺血对照组鼠心肌细胞荧光强度明显增强(P<0.05);无缺氧鱼藤酮组和缺血鱼藤酮组心肌AF强度均显著增强,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。R0组人心肌细胞AF强度显著弱于无缺氧对照组鼠心肌细胞(P<0.05);人心肌AF强度与排斥反应相关,R1的荧光强度显著增强(P<0.05),但光谱形态无改变,与缺血对照组鼠心肌细胞光谱改变一致。结论光谱分辨的荧光光谱结合荧光寿命分析是监测心肌线粒体氧化代谢的敏感方法,有良好的重复性。人心肌AF表现出较高的代谢活性,排斥反应时活性降低。该技术结合多光子共聚焦显微镜,可直接在体评估线粒体功能,是监测早期排斥反应的新方法。