减毒结核分枝杆菌H37Ra感染小鼠模型的实验研究

目的:研究减毒结核分枝杆菌(M.tb)H37Ra感染小鼠模型及其病理损伤的机制。方法:将清洁级Balb/c小鼠分为对照组和M.tb模型组,各3只。将H37Ra按照每只小鼠1×106CFU的剂量,经尾静脉注射感染小鼠,分别于感染7、14和21 d后,无菌操作取小鼠肺和脾脏组织,测量肺和脾脏的脏器系数,匀浆后行活菌培养;肺和脾脏组织冷冻切片,行HE染色观察病理损伤情况。结果:小鼠感染M.tb 14和21 d后,脾脏脏器系数均较感染7 d后显著升高(P<0.01和P<0.05)。感染7 d后,肺和脾脏组织匀浆均可检出活菌,脾脏组织H37Ra活菌量明显高于肺脏,并随感染时间逐渐增加;感染14 d后,肺组织病理观察可见明显感染性病变损伤。结论:M.tb H37Ra经尾静脉注射感染小鼠模型可造成部分结核病样病理性损伤。

肥大细胞在免疫反应中的调节作用

肥大细胞(MC)起源于造血干细胞,包括黏膜MC和结缔组织MC两个亚群。机体中MC不仅可作为效应细胞,也可作为免疫调节细胞起作用。它可通过MHC分子对抗原进行加工、递呈,也可产生化学因子募集T细胞。在免疫反应中,MC一方面通过直接接触或产生的TNF-α、蛋白酶类正向调节免疫应答,另一方面也可通过分泌IL-10等分子负向调节免疫应答。

流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌的方法学探讨

目的：建立流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的方法。方法：用不同浓度荧光素（FITC）标记Mtb,流式细胞术检测FITC对Mtb的标记率。健康人外周全血与FITC标记Mtb（FITC-Mtb）于37℃共孵育10~120 min,溶解红细胞,洗涤后加台盼蓝淬灭未吞噬的FITC-Mtb的荧光,流式细胞术检测FITC阳性单核细胞的数值,计算单核细胞对Mtb的吞噬率。FITC-Mtb与佛波醇酯（PMA）激活分化的THP-1细胞以10∶1的比例共孵育1~6 h,或以1∶1~100∶1的比例孵育1 h和2 h,用同样的方法检测吞噬率。结果：FITC（50μg/ml）与Mtb作用2 h的标记率达92%。人单核细胞对FITC-Mtb的吞噬率从10 min的34.68%增加至120 min的79.90%。THP-1细胞对FITC-Mtb的吞噬率从1 h的30%增加至6 h的81%。FITC-Mtb与THP-1细胞以100∶1比例孵育1 h,吞噬率达平台（81%）;以50∶1的比例孵育2 h,吞噬率达平台（82%）。未加台盼蓝淬灭时,单核细胞在10 min和120 min对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比,分别增加29%和6%;而未加台盼蓝淬灭时,THP-1细胞在1 h和6 h对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比分别增加1%和7%。结论：流式细胞术检测人单核巨噬细胞吞噬FITC标记Mtb是测定单核巨噬细胞对Mtb吞噬活性的简便、快速和重复性好的方法。

人工合成的siRNA转染外周血活化T淋巴细胞方法学研究

观察人工合成siRNA与脂质体DMRIE-C Reagent的复合物对人外周血活化T淋巴细胞转染效果。人外周血标本中分离的外周血单个核细胞用抗原和IL-2刺激扩增培养,产生活化的T淋巴细胞,用不同配比浓度的荧光标记的siRNA-FAM与脂质体的复合物转染活化后的T淋巴细胞,分别采用转染一次和连续转染两次的方法,并在转染后4h,分别取样本,通过流式细胞测定技术,比较两种方法的转染效率,并筛选出最佳转染效率剂量配比。活化T细胞用转染一次和两次的方法后,平均转染阳性率分别为(12.5±0.64)%和(50.37±6.77)%。采用连续两次转染的方法进行转染,转染效率要明显高于一次转染法。

结核分枝杆菌感染对THP-1细胞CD14表达的影响

目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染THP-1细胞后对细胞表面白细胞分化抗原14(CD14)表达的影响。方法:Mtb以10∶1感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1细胞,建立Mtb感染THP-1细胞的模型。采用流式细胞术检测THP-1细胞、PMA分化的THP-1细胞及Mtb感染THP-1细胞CD14的表达。结果:THP-1细胞和PMA分化的THP-1细胞表面表达CD14的阳性率分别为5.5%和21.6%,对Mtb的吞噬率分别为7.7%和93.0%;Mtb感染的THP-1细胞表面表达CD14的阳性率为27.5%。结论:PMA分化后的THP-1细胞表面CD14的表达增加,Mtb感染后CD14的表达进一步增加,对Mtb的吞噬率增加。

流式细胞术检测中性粒细胞产生活性氧方法学探讨

目的：建立用流式细胞术检测人外周血中性粒细胞（polymorphonuclear cells,PMN）产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）的方法。方法：健康人外周全血或用Percoll分离的PMN,加探荧光针双氢罗丹明123（DHR123）或2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作用15 min,再加佛波醇酯（phorbo 12-myristate 13-acetate,PMA）于37℃作用5－90 min后,用流式细胞仪检测PMN内的罗丹明123（rhodamine 123,RHO）或氧化型二氯荧光素（dichlorofluorecin,DCF）的荧光强度,以反映PMN内ROS产生的水平。结果：以DHR123为荧光探针时,PMA刺激全血或分离PMN产生ROS的时间动力学相似,在37℃作用5－60 min ROS量呈递增趋势,且在60 min左右达到峰值,60－90 min时渐下降。以DCFH-DA为荧光探针时,PMA刺激全血PMN产生ROS,在37℃作用5 min时反应生成ROS量达到峰值,随后出现明显递减趋势,而PMA刺激分离PMN产生ROS在5－30 min逐渐增高并在60－90 min达平台期。实验中还发现甲醛试剂可以降低RHO的荧光强度。结论：采用流式细胞术检测PMN产生ROS是一种简便、可靠、稳定的方法。

正常人外周血自然杀伤T细胞(CD3^+CD16^+CD56^+)比例

目的:探讨正常人外周血中自然杀伤T(NKT)细胞(CD3+CD16+CD56+)比例的95%参考值范围。方法:取141名正常成年人和30例肺癌患者外周血,直接双色荧光抗体染色,溶血洗涤后用流式细胞仪检测NKT细胞和T细胞各亚群的数量。分析获取的结果以百分位数计算95%的正常值范围。结果:141名正常人外周血NKT细胞(CD3+CD16+CD56+)的百分率平均数为4.16%,标准差为4.13%,以百分位数法获得95%参考值范围为(0.78~11.71)%;18~30岁组、31~50岁组和51~70岁组的NKT细胞(CD3+CD16+CD56+)比例的平均数分别为4.64%,3.91%和3.57%,差异无统计学意义(P>0.05);30例肺癌患者组与正常组该项指标的差异亦无统计学意义(P>0.05)。同时检测到正常人CD3+细胞、CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值以及NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的比例均与大多数报道的正常值相似。结论:正常人外周血中NKT细胞(CD3+CD16+CD56+)比例的95%参考值范围是(0.78~11.71)%,平均数为4.16%,中位数为2.97%,虽然NKT细胞比例随年龄增加而减少,但两者之间无直线相关关系。未发现肺癌组患者NKT细胞比例与正常人有显著性差异。

新生儿脐带血CD4^＋CD25^high调节性T细胞Foxp3的表达

目的:检测新生儿脐带血CD4+CD25high调节性T细胞(Treg)数量及胞内转录因子Foxp3的表达,探讨Treg细胞在新生儿期的表达特点。方法:采集新生儿脐带血(n=15)和成人外周血(n=12),密度梯度离心法获取单个核细胞用荧光标记单克隆抗体(mAb)作表面和胞内染色后,在流式细胞仪上检测CD4+CD25high Treg细胞的数量及其胞内转录因子Foxp3的表达。结果:脐带血Treg细胞占CD3+CD4+T细胞的比例(3.86%±1.63%)明显高于成人外周血(0.87%±0.74%,P<0.01);而脐带血Treg细胞中表达Foxp3的比例明显低于外周血Treg细胞(23.21%±8.9%vs71.3%±11.6%,P<0.01)。结论:虽然新生儿脐带血CD4+CD25high Treg细胞数量明显高于成人外周血,但Foxp3+细胞数量明显低于成年人,提示在功能上可能尚未成熟。

结核分枝杆菌蛋白抗原刺激人γδT细胞的活性单位的计算方法

目的以检测和计算结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)蛋白抗原激活人γδT细胞增殖的活性单位为指标,比较不同提取分离方法制备的Mtb抗原制剂激活人γδT细胞的活性效价。方法培养的Mtb-H37Ra菌株通过高温和超声方法处理,分别获取Mtb耐热抗原(Mtb-HAg)和超声处理抗原(Mtb-SoAg),采用超滤离心管(3 K,10 K,30 K)和快速液相蛋白层析(FPLC)分组和分离,获取不同相对分子质量组分的抗原。采集健康成年人外周血分离获取PBMC,加入不同质量浓度梯度的Mtb蛋白抗原或其分离组分,并加IL-2培养12 d后荧光抗体染色,流式细胞仪检测和分析扩增T细胞中γδT细胞的比例,以扩增γδT细胞最高比例的50%(EC50)所对应的质量浓度计算为1个活性单位。结果用活性单位计算法分析发现,某批次的Mtb-HAg(591μg/ml)刺激γδT细胞扩增的EC50为1.4μg/ml,计算其活性单位为0.71 U/μg;某批次低分子Mtb-SoAg(3 K～10 K)(221μg/ml)的EC50为0.8μg/ml,其活性单位为1.25 U/μg。结论通过比较Mtb蛋白抗原不同批次及其不同组分在不同质量浓度下刺激γδT细胞扩增数量的活性,可以计算获得相应的活性单位,为检测Mtb蛋白抗原制剂刺激γδT细胞增殖活性建立了标准化的计算方法。

结核病患者中性粒细胞表面Toll样受体2和Toll样受体4的表达及意义

目的:检测结核病患者外周血中性粒细胞(PMN)体外感染结核分枝杆菌(M.tb)前后表面Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)的表达,并探讨其意义。方法:采用流式细胞仪检测结核病患者PMN表面TLR2和TLR4的表达,同时检测正常人PMN表面TLR2和TLR4的表达率;再用M.tb感染结核病患者和正常人外周血,检测PMN表面TLR2和TLR4表达情况。结果:结核病患者外周血感染M.tb前PMN表面TLR2和TLR4表达率明显高于正常人(P<0.01);结核病患者和正常人外周血在感染M.tb后PMN表面TLR2和TLR4表达率均较感染前明显降低(P<0.01)。结论:结核病患者PMN表面TLR2和TLR4的表达和活化有助于机体抵御结核感染,TLR2和TLR4共同参与了宿主对M.tb的免疫应答。

脂多糖对结核病患者外周血单核细胞Toll样受体4表达及细胞内活性氧产生的影响

目的:探讨脂多糖(LPS)对结核病患者外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)表达及细胞内活性氧(ROS)产生的作用。方法:收集健康志愿者外周血标本和结核病患者外周血标本,各13例;取二者肝素抗凝血100μL,荧光探针DHR123或抗人anti-TLR4-PE荧光素标记抗体,全血染色后,流式细胞仪技术检测分析二者外周血单核细胞TLR4表达及细胞内ROS产生水平;再取二者抗凝血100μL于96孔培养板中,按如下分组进行处理:健康志愿者抗凝血为A组,结核病患者抗凝血为B组,结核病患者抗凝血+LPS 100 ng/m L为C组,每组6孔,培养24 h后,流式细胞仪技术检测单核细胞TLR4表达及细胞内ROS产生水平。结果:结核病患者外周血单核细胞TLR4阳性表达率为(17.6±3.6)%,较健康志愿者的(30.0±2.4)%显著降低(P<0.01);结核病患者外周血单核细胞细胞内ROS水平(74.8±11.4)较健康志愿者(109.6±13.2)显著降低(P<0.01)。LPS刺激24 h后,C组单核细胞胞内ROS水平(182.1±11.3)与B组(127.6±14.1)相比差异有统计学意义(P<0.01);C组单核细胞TLR4阳性表达率为(62.1±3.3)%,与B组的(47.6±4.7)%差异有统计学意义(P<0.01)。结论:LPS可促进结核病患者外周血单核细胞TLR4表达及细胞内ROS产生水平。

miR-20b抑制哮喘小鼠的气道炎症

目的探讨miR-20b对哮喘小鼠气道炎症的影响。方法 BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘组、哮喘+miR-20b模拟物处理组、哮喘+miR-20b模拟物对照处理组。卵清白蛋白(OVA)致敏和激发构建哮喘模型小鼠,miR-20b模拟物及其对照采用鼻滴的方式给药干预。实验流程的第49天检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数和分类计数,肺组织进行HE染色观察病理学变化,ELISA检测BALF中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度。结果哮喘小鼠经miR-20b模拟物处理后,BALF中细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的分类计数明显降低(P<0.01),并且气道黏膜增厚减轻,气道腔内粘液分泌及支气管周围炎性细胞的浸润减少。与哮喘组BALF中VEGF的含量28.55±3.42 pg/m L相比,哮喘+miR-20b模拟物处理组的含量18.19±3.67 pg/m L明显降低(P<0.01)。结论 miR-20b对哮喘小鼠气道炎症产生抑制作用,这一效应可能是通过降低VEGF的表达来介导。

Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响

目的：用流式细胞术观察Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ,以及Th1细胞诱导因子IL-12对人外周血中性粒细胞吞噬功能的影响。方法：用不同浓度异硫氰酸荧光素（FITC）在碳酸盐缓冲液（CB,pH9.5）和磷酸盐缓冲盐水（PBS,pH7.2）中标记大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌（金葡菌）,流式细胞术检测细菌标记率。取新鲜健康成人外周血与标记细菌于37℃孵育5-20 min后,洗涤和溶血,用流式细胞术检测中性粒细胞吞噬百分率。或外周血预先分别与IL-2、IFN-γ及IL-12孵育2 h,再加标记细菌孵育5 min,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬率,并与对照组比较计算吞噬增加比率。结果：FITC标记大肠埃希菌在碱性的CB中标记率较高,而金葡菌在中性的PBS标记率较高（P〈0.01）。健康人外周血中性粒细胞对大肠埃希菌和金葡菌的吞噬率在5 min时分别为45%和38%,15-20 min达到平台期,分别为86%-88%和83%-89%。外周血预先用IL-2（20u/ml）、IFN-γ（50 u/ml）或IL-12（30 u/ml）作用后,中性粒细胞对大肠埃希菌的吞噬率分别增加19%、19%和26%;对金葡菌的吞噬率分别增加25%、23%和35%。结论：Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及Th1型诱导细胞因子IL-12均能增强人中性粒细胞吞噬功能,Th1型细胞因子和IL-12均具有增强中性粒细胞功能的作用。

幽门螺杆菌对胃黏膜上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的：探讨幽门螺杆菌（Hp）对胃黏膜上皮细胞（GES-1）自噬和凋亡的影响。方法：Hp与GES-1体外共培养，同时设立雷帕霉素（RAPA）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预组及空白对照组，于2、4、6、12及24 h终止感染，通过免疫蛋白印迹、荧光染色、透射电镜、流式细胞术及细胞内活菌计数等方法观察Hp对GES-1自噬和凋亡的影响。结果：Hp＋GES-1组在2 h出现自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达及细胞内荧光自噬颗粒，透射电镜观察到细胞内出现双层或多层膜包裹的自噬小体样结构，细胞自噬在4 h达高峰，感染中后期逐渐减弱并消失；RAPA＋Hp＋GES-1组细胞自噬程度进一步增强，细胞凋亡率及细胞内活菌数均降低（P〈0.05-P〈0.01）；3-MA＋Hp＋GES-1组细胞自噬强度显著降低，而其细胞凋亡率和细胞内活菌数均明显升高（P 〈0.01）。结论：Hp可在感染早期诱导GES-1自噬；RAPA和3-MA可增强或降低自噬发生程度，从而减轻或促进细胞损伤。

SCF/c-Kit信号促进膀胱癌T24细胞侵袭作用

目的探讨SCF/c-Kit信号对膀胱癌T24细胞侵袭性的影响。方法采用Western blot检测T24细胞c-Kit表达及经SCF刺激后PI3K途径激活情况;Transwell侵袭实验(直接与间接计数法)观察T24细胞经过SCF(1 ng/ml)刺激前后及使用Wortmannin(特异性PI3K阻断剂)预处理后侵袭性的变化。结果 T24细胞存在c-Kit蛋白的表达并且经SCF(1 ng/ml)作用24 h后,出现明显的磷酸化Akt;与对照组相比,SCF(1 ng/ml)刺激组穿过聚碳酸酯膜的T24细胞数明显增多(P<0.01),而Wortmannin预刺激阻断了SCF的这种效应。结论 SCF/c-Kit信号促进了T24细胞的侵袭性,这一效应是由PI3K途径介导的。

miR-20b对小鼠RAW264.7细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

目的探讨miR-20b对小鼠RAW264．7细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法以不同浓度（1、10、50、100、200ng／mL）TNF-α刺激小鼠RAW264．7细胞24h，ELISA法检测上清中VEGF的分泌情况。TNF-α（50ng／mL）刺激RAW264．7细胞6h，Real-TimePCR检测miR．20b和VEGFmRNA的表达。使用PicTar算法预测VEGF是否为miR-20b的调控靶点。利用脂质体Lipofectamine2000介导miR-20b模拟物及其对照转染RAW264．7细胞，用TNF-α（100ng／mL）刺激24h，ELISA法检测VEGF的产生情况。结果TNF-α能够诱导小鼠RAW264．7细胞分泌VEGF，50-100ng／mLTNF-α．是最适合的刺激浓度；50ng／mLTNF-α刺激RAW264．7细胞6h，VEGFmRNA的相对表达量升高至对照组的（1．60±0．85）倍，而miR-20b的相对表达量降至对照组（0．55±0．33）倍。PicTar算法表明，小鼠VEGF的3’-UTR区含有miR-20b种子区域AAAGUGC的互补序列GCACUUU。转染miR-20b模拟物后，TNF-α诱导的VEGF蛋白表达升高被完全抑制（P〈0．01），但转染miR-20b模拟物对照对VEGF的产生无明显影响（P〉0．05）。结论小鼠RAW264．7细胞中miR-20b负性调节VEGF的表达。

人外周血白介素-22产生细胞在不同淋巴细胞亚群中的比例

目的:采用流式细胞术(flow cytom etry,FCM)检测人外周血不同淋巴细胞亚群中白介素-22(IL-22)产生细胞的比例。方法:健康人外周全血用肝素抗凝管采集后与相同体积RPM I 1640培养液混匀,加入佛波酯和离子霉素,于37℃、5%CO2静置培养2 h,再加入莫能霉素后继续培养4 h收集细胞。用荧光素标记单抗进行细胞表面抗原和胞内细胞因子染色,用FCM检测表达IL-22、IL-17的细胞在不同淋巴细胞亚群中的比例。结果:IL-22产生细胞在CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞的表达比例分别为1.83%、2.12%、0.67%、1.96%和1.09%,CD4+T细胞中的比例明显高于CD8+T细胞中的比例(P<0.01)。另外,在CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞中,均检测到共表达IL-22和IL-17的细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:用FCM检测IL-22产生细胞在CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和B细胞均有表达,在CD4+T细胞的比例明显高于CD8+T细胞。

GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析

目的:纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性。方法:将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗菌活性。结果:GST-颗粒溶解素融合蛋白能以可溶性形式在大肠埃希菌中表达,采用亲和层析法可获得分子量为44kDa的单一蛋白条带。经抗菌活性分析,表明纯化产物对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌具有显著抑制作用,而对伤寒沙门菌和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显。结论:成功纯化GST-颗粒溶解素融合蛋白,该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性。

不同刺激剂对健康人和结核患者外周血T细胞产生γ干扰素和肿瘤坏死因子-α的影响

目的：检测健康人和结核患者外周血经不同刺激剂刺激后T细胞亚群产生γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的变化。方法：12名健康人和12例结核患者的外周血单个核细胞用佛波醇脂（PMA）＋钙离子霉素（IM）、结核杆菌耐热抗原（Mtb-HAg）、植物血凝素（PHA）刺激,莫能霉素阻断,流式细胞仪检测产生IFN-γ和TNF-α的T细胞亚群比例。结果：PMA＋IM刺激健康人外周血αβT细胞产生IFN-γ的比例明显高于结核患者（P〈0.01）;PMA＋IM、Mtb-HAg和PHA刺激健康人外周血γδT细胞产生IFN-γ的比例高于结核患者（P〈0.05～P〈0.01）。PMA＋IM和PHA刺激健康人外周血αβT细胞产生TNF-α的比例均高于结核患者（P〈0.05）;PMA＋IM和PHA刺激健康人外周血γδT细胞产生TNF-α的比例均高于结核患者（P〈0.05）。结论：经不同刺激剂刺激后,健康人γδT细胞产生IFN-γ的比例高于结核患者γδT细胞产生IFN-γ的比例。经PMA和PHA刺激后,健康人αβT和γδT细胞产生TNF-α的比例高于结核患者。

脂筏干扰剂甲基-β-环糊精对血小板活化和聚集的影响

目的:探讨脂筏干扰剂甲基-β-环糊精(MβCD)在体外对血小板活化和聚集的影响。方法:采静脉全血静止20 m in后加二磷酸腺苷(ADP)20μmol/L刺激10 m in,或预先用MβCD(10 mmol/L)处理后再加ADP刺激;同时设立未加ADP为实验对照组。用流式细胞术检测血小板中表达膜表面活化纤维蛋白原受体(FIB-R)阳性比例及其平均荧光强度(MFI)和血小板聚集率。结果:ADP刺激组血小板中FIB-R阳性比例(%)、FIB-R(MFI)和血小板聚集率(%)分别为75.93±10.27、329.19±121.72和23.03±4.96,实验对照组则分别为66.66±12.58、73.78±21.91和2.53±0.72,其中后两种指标差异有统计学意义(P<0.01)。MβCD预处理加ADP刺激组的三项指标均比ADP刺激组显著降低(P<0.01)。结论:具有转移细胞膜胆固醇的MβCD在体外能显著抑制ADP诱导的血小板活化和聚集。