外源性一氧化氮体外杀伤红内期间日疟原虫的实验研究

目的探讨外源性一氧化氮(NO)对红内期间日疟原虫的杀伤作用。方法采集以早期滋养体期为主,原虫密度>0.5%的患者血样,配成含2%红细胞的虫血混悬液。96孔板中每孔加100μl虫血混悬液,再加入各组试剂,亚硝基铁氰化钠(SNP,分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mmol/L),SNP+血红蛋白(Hb)0.15mmol/L,SNP+硫酸亚铁(FeSO4)0.15mmol/L,SNP+L-半胱氨酸(L-cyst)1.00mmol/L,SNP+FeSO40.15mmol/L+L-cyst1.00mmol/L,后4组SNP浓度均为1.00mmol/L,设对照组,每组重复3次,置37℃5%CO2培养箱中培养。根据虫龄,估计发育至裂殖体时间,提前3h取空白对照孔涂片镜检,确定终止培养时间,培养终止后吉氏染色,镜检计数成熟裂殖体,计算NO对红内期间日疟原虫的抑制率,统计分析各组对间日疟原虫抑制率的差异。结果SNP0.02mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(0.84±1.69)%,对培养的红内期间日疟原虫无杀伤作用(P>0.05);SNP0.05mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(12.26±3.04)%,对培养的红内期间日疟原虫存在杀伤作用(P<0.01)。且抑制率随SNP浓度上升而升高。在含有1.00mmol/LSNP的孔中分别加入Hb、L-cyst、FeSO4和FeSO4+L-cyst与只添加SNP1.00mmol/L孔相比,红内期间日疟原虫抑制率自(85.40±2.90)%下降为(5.90±2.90)%、(25.86±4.02)%、(30.16±2.75)%和(16.71±2.30)%。结论外源性NO对体外培养的红内期间日疟原虫有杀伤作用,而Hb、L-cyst和FeSO4可以逆转这种杀伤作用。

安徽省沿淮地区中华按蚊溴氰菊酯抗性及代谢解毒酶活性kdr突变频率调查

目的了解安徽省沿淮地区疟疾媒介中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗性状况及谷胱甘肽S转移酶(GSTs)、细胞色素氧化酶(P450s)等代谢解毒酶活性和钠离子通道击倒抗性基因(Knockdown resistance,kdr)的突变情况。方法2011年8-9月采集安徽省蚌埠市李楼乡、沫河口镇和沱湖乡中华按蚊成蚊样本,采用WHO成蚊接触筒药膜滤纸接触法,调查3个地区中华按蚊对溴氰菊酯抗性状况。随机挑选样本采用生化法检测代谢解毒酶活性并用PCR扩增产物直接测序法检测分析钠离子通道kdr基因IIS6片段L1014位点基因型。结果李楼乡、沫河口镇和沱湖乡3个检测点的中华按蚊对溴氰菊酯60 min内击倒率分别为4.1%、7.0%和8.2%,恢复24 h后校正死亡率分别为8.2%、12.0%、12.8%,均为抗性种群。3个检测点的中华按蚊GSTs和P450s活性均显著高于实验室敏感种群(P<0.001)。3个检测点的中华按蚊kdr基因均发生突变,存在L1014C和L1014F两种突变类型,无野生纯合型(TTG/TTG),实验室敏感种群kdr基因均为无突变的野生纯合型。结论安徽省沿淮地区的中华按蚊已对溴氰菊酯产生较强的抗性,代谢解毒酶活性比实验室敏感种群显著升高,钠离子通道kdr基因L1014位点出现高频率的突变。

安徽省中北部淡色库蚊对多种杀虫剂抗性及其kdr基因突变研究

目的了解安徽省中北部地区淡色库蚊对多种杀虫剂的抗药性现状及其kdr基因突变情况。方法 2014年6-9月在淮北市、蚌埠市和滁州市3地采集淡色库蚊幼虫,带回实验室饲养至成虫,采用WHO成蚊接触筒药膜滤纸接触法对其进行0.05%溴氰菊酯、5%马拉硫磷、0.1%噁虫威、4%DDT抗性生物测定。以PCR扩增经溴氰菊酯抗性测定的库蚊抗性相关kdr基因并进行测序,统计L1014位点突变情况。结果上述3个地区淡色库蚊对溴氰菊酯、马拉硫磷、噁虫威、DDT 4种杀虫剂都产生了不同程度的抗药性,对DDT产生的抗性较高;虽然3地淡色库蚊接触DDT后的死亡率差异无统计学意义(F=1.027,P>0.05);但接触溴氰菊酯、马拉硫磷、噁虫威后的死亡率差异均有统计学意义(F=23.823、33.955、128.841,P均<0.01)。3地淡色库蚊种群的kdr基因1014位点均存在L1014F、L1014S这2种非同义突变;L1014F突变频率与溴氰菊酯抗性水平呈正相关(r2=0.718,P<0.01)。结论安徽省中北部地区淡色库蚊对溴氰菊酯、马拉硫磷、噁虫威、DDT均产生了较强的抗性,kdr基因L1014F突变频率与溴氰菊酯抗性水平呈正相关;各地区卫生部门需加强对媒介蚊虫抗性的动态监测。

刚地弓形虫速殖子侵入宿主细胞涉及的丝裂原蛋白激酶信号途径的研究

丝裂原蛋白激酶（MAPKs）是一类存在于所有真核细胞的丝／苏氨酸蛋白激酶，在真核细胞的信号转导过程中起着至关重要的作用。MAPKs磷酸化激活多种转录因子，影响基因表达，调节细胞增殖、分化、凋亡等过程，并在弓形虫速殖子侵入宿主细胞的信号转导中有着重要的意义。

小鼠疟原虫感染经氯喹治疗痊愈后再感染免疫特征分析

目的探讨疟原虫感染小鼠在原虫血症高峰期经氯喹治愈后,再感染同/异种疟原虫的疾病进程和免疫保护特征。方法用非致死型约氏疟原虫17XNL株(P.y 17XNL株)感染C57BL/6小鼠,感染率达高峰时(第9天)半数小鼠以氯喹治疗,其余小鼠自然痊愈。痊愈后小鼠于初次感染90 d后分别采用等量致死型约氏疟原虫17XL株(P.y 17XL株)或伯氏疟原虫ANKA株(P.b ANKA株)再次感染,采用吉姆萨薄血膜染色法观察原虫血症水平变化,并应用酶联免疫吸附试验和流式细胞术分别检测再感染前后小鼠血清中IgG抗体水平和脾细胞中记忆性T细胞亚群比例。结果初次感染P.y 17XNL株后,自愈与氯喹治愈组小鼠血清IgG抗体水平分别为(5.047±0.924)、(4.429±0.624)pg/mL,差异无统计学意义(t=0.437,P>0.05);但均显著高于无感染正常组小鼠的(1.624±0.280)pg/mL(F=22.522,P<0.01)。自愈和氯喹治愈组小鼠再感染P.y 17XL株或P.b ANKA株并痊愈后,各组小鼠血清IgG抗体水平分别为(15.487±1.173)、(14.644±1.523)、(15.965±1.150)pg/mL和(15.185±1.333)pg/mL,差异无统计学意义(F=0.542,P>0.05);但均高于初次感染组,差异有统计学意义(F=67.383,P<0.01)。感染P.y 17XNL株后自愈及氯喹治愈组小鼠再感染P.y 17XL株或P.b ANKA株并痊愈后,各组小鼠CD4+记忆性T细胞比例分别为(34.023±2.289)%、(35.608±1.779)%、(34.208±2.106)%和(32.820±1.930)%,CD8+记忆性T细胞比例分别为(17.103±1.627)%、(17.873±1.425)%、(17.935±2.092)%和(18.918±2.823)%,组间差异均无统计学意义(F=0.944、0.390,P均>0.05);但均高于初次感染后小鼠,且差异有统计学意义(CD4+记忆性T细胞,F=50.532,P<0.01;CD8+记忆性T细胞,F=21.751,P<0.01)。结论小鼠疟疾经氯喹治疗痊愈不影响宿主在再感染时产生有效免疫保护力。初次感染后,小鼠对同种和异种疟原虫再感染均具有一定保护性且对同种疟原虫再感染的抵抗力强于异种疟原虫。

以形成性评价为导向改革人体寄生虫学课程教学评价方式探讨

形成性评价指在教学过程中进行的动态、多次的评测。以形成性评价为导向,结合总结性评价应用于人体寄生虫学课程教学中,能充分调动学生的学习积极性,科学、全面评估学生能力,推动了教学方法与手段的改革和创新,促进了教学水平的提高。

猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞表位预测及鉴定

目的预测并鉴定猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞表位。方法利用生物信息学在线工具分析TSO45-4B抗原FnⅢ结构域序列并预测其线性B细胞表位;采用SWISS-MODEL软件预测TSO45-4B的蛋白空间结构,并合成两条预测表位肽。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪囊尾蚴病人血清与两条预测表位肽的免疫反应性。结果获得2个TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞预测表位,其中1条预测表位合成肽可为猪囊尾蚴病患者血清识别。结论成功预测并鉴定了猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞表位。

金丝桃素体外抗刚地弓形虫速殖子效果的观察

目的观察金丝桃素对体外培养的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子的杀伤作用,探讨金丝桃素抗弓形虫的效果。方法将生理盐水(A组)和终浓度为5μg/ml(B组)、50μg/ml(C组)、500μg/ml(D组)的金丝桃素分别加入含弓形虫速殖子1×106个/孔的24孔培养板中,于2、4、6 h后收集虫体,台盼蓝染色检测速殖子着色率,吉氏染色观察速殖子形态和结构变化,透射电镜观察速殖子超微结构的变化,流式细胞仪检测相同处理的携带黄色荧光蛋白的弓形虫的存活情况。结果弓形虫速殖子经不同浓度金丝桃素作用2 h后,B组、C组和D组虫体的台盼蓝着色率分别为(11.0±3.6)%、(25.0±6.3)%和(40.0±2.7)%,D组着色率高于C组和B组(P<0.01),3组均高于A组(6.0±3.0)%,但B组和A组间差异无统计学意义(P>0.05)。作用4 h后,D组着色率为(97.0±2.0)%,高于C组(30.0±7.2)%、B组(20.0±3.0)%和A组(10.0±1.0)%(P<0.01);作用6 h后,D组着色率为(98.0±1.7)%,亦高于C组(42.7±5.5)%、B组(34.0±6.6)%和A组(19.3±4.9)%,两两比较,各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。吉氏染色观察发现,随时间的延长和剂量的增高,虫体两端逐渐变圆、肿胀、坏死。透射电镜观察结果显示,随金丝桃素作用时间延长,虫体逐渐肿胀,胞膜与基质间出现明显空隙,虫体内空泡增多、变大,胞膜破裂,内部结构溶解。流式细胞仪检测结果表明,弓形虫速殖子存活率在金丝桃素作用后的各时间段内与对照组间差异有统计学意义(P<0.01);金丝桃素作用2 h后,D组无弓形虫存活,C组弓形虫存活率为(7.9±1.9)%,低于B组(38.1±5.5)%和A组(81.8±6.0)%(P<0.01);作用4 h后,C组无弓形虫存活;B组在作用4 h和6 h后,弓形虫存活率分别为(14.3±7.9)%和(1.4±1.8)%,均低于A组的(73.8±11.3)%和(64.1±14.4)%(P<0.01)。结论金丝桃素具有较强的体外抗弓形虫速殖子效果,且随剂量增高和作用时间延长抗虫效果更明显。

间日疟原虫氯喹抗性研究进展

疟疾仍然是一个严重危害人类健康的公共卫生问题,尤其多见于发展中国家。随着认识的深入,间日疟也获得越来越多的重视。有效的药物治疗是控制疟疾甚至消除疟疾的基石,近年来已有越来越多的间日疟原虫氯喹抗性报道,间日疟原虫氯喹抗性已成为间日疟防治中一个备受关注的问题。本文就间日疟原虫氯喹抗性的分布现状、体内外检测方法和分子检测标志物研究进展进行初步总结。

亚硝基铁氰化钠来源的外源性NO体外杀伤旋毛虫肌幼虫作用研究

目的探讨亚硝基铁氰化钠(SNP)来源的NO体外杀伤旋毛虫肌幼虫的作用及其相关机制。方法制作浓度为1 000条/ml的旋毛虫肌幼虫悬液。培养板每孔加入0.1 ml肌幼虫悬液,再加入SNP,使其终浓度分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L和1.00 mmol/L,并设空白对照组,37℃5%CO2培养箱中孵育4 d后收集各孔肌幼虫,镜检计数,计算并比较各组肌幼虫死亡率。另于培养板中每孔加入0.1 ml肌幼虫悬液,分别设A组(对照组,1.00 mmol/L SNP)、B组(0.15 mmol/L Fe SO4+1.00 mmol/L SNP)、C组(1.00 mmol/L L-半胱氨酸+1.00 mmol/L SNP)、D组(0.15 mmol/L Fe SO4+1.00mmol/L L-半胱氨酸+1.00 mmol/L SNP)、E组(0.15 mmol/L Hb+1.00 mmol/L SNP),培养、检测方法同前,计算并比较各组肌幼虫死亡率。结果 0.02 mmol/L SNP组与空白对照组的旋毛虫肌幼虫死亡率分别为(5.50±1.80)%和(4.93±0.25)%(P>0.05)。0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mmol/L SNP组虫体死亡率分别为(20.19±2.71)%、(29.21±2.12)%、(41.81±2.03)%、(47.85±3.79)%和(60.98±5.19)%,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。旋毛虫肌幼虫死亡率与SNP浓度呈正相关(rs=0.875,P<0.05)。B、C、D、E组肌幼虫死亡率分别为(49.48±1.34)%、(47.29±2.79)%、(26.28±1.37)%和(17.93±3.49)%,均较A组(60.98±5.19)%有所下降(P均<0.05)。结论 SNP来源NO对体外培养的旋毛虫肌幼虫具有杀伤作用,而血红蛋白、硫酸亚铁、L-半胱氨酸对该杀伤具有抑制作用,以血红蛋白抑制效果最显著。

恶性疟原虫配子体期特异性蛋白Pfgdv1克隆表达及鉴定

目的克隆恶性疟原虫配子体期特异性基因(Plasmodium falciparum gametocyte development 1 gene,Pfgdv1),体外表达和鉴定重组Pfgdv1蛋白。方法通过PCR法从恶性疟原虫感染病人血液DNA样本中扩增Pfgdv1基因,插入到原核表达载体p ET28a(+),构建p ET28a-Pfgdv1重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达重组蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定。结果 PCR扩增的Pfgdv1基因长度约为1.65 kb,重组p ET28a-Pfgdv1质粒构建成功,插入方向正确无框移,转化至E.coli BL21(DE3+)所表达的重组蛋白分子量约为67 k Da,且能被抗His标签单克隆抗体识别。结论成功克隆了Pfgdv1基因,表达并纯化了重组Pfgdv1蛋白,为进一步研究恶性疟原虫配子体期传播阻断疫苗奠定了基础。