肝内胆管细胞癌组织中PD-L1表达及与临床病理特征的关系

目的:利用免疫组化方法检测肝内胆管细胞癌组织中程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的表达情况,进而研究PD-L1表达与肝内胆管细胞癌临床病理因素之间的关系。方法:选取2014年1月至2017年12月就诊于蚌埠医学院第一附属医院并且接受手术治疗的60例肝内胆管细胞癌患者癌组织并选取其中40例癌旁组织作为对照,采用免疫组织化学法检测PD-L1分子在60例癌症组织以及40例癌旁组织中的表达情况,在此基础上探究肝内胆管细胞癌中PD-L1表达与临床病理因素之间的关系。结果:PD-L1分子在肝内胆管细胞癌组织中的表达与癌旁组织相比存在显著差异,差异有统计学意义(51.7%vs 5%,P<0.05);不同TNM分期间及不同淋巴结转移情况中,PD-L1分子表达差异具有统计学意义(P<0.05);肝内胆管细胞癌患者性别、年龄、分化程度和肿瘤直径与PD-L1表达无关,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:肝内胆管细胞癌组织中PD-L1分子呈高表达,并且很大可能推动肿瘤的发生发展。

整合PD-L1单链抗体的融合蛋白制备及其抗肿瘤活性的验证

目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(sc Fv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(sc Fv)。根据单链抗体基因序列,合成sc Fv抗体基因序列。选用sc Fv-mFc融合蛋白的方式,并采用p Fuse真核表达载体来表达此sc Fv-mFc融合蛋白,研究其对肺腺癌细胞(A549)的亲和力和体内外抑制作用。方法:采用基因工程的方法构建重组质粒p Fuse-scFv,通过真核转染至293F(人胚肾细胞),使用无血清Pro 293a-CDM培养72 h,收集培养液中分泌的融合蛋白,运用免疫组化检测sc Fv-mFc融合蛋白与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析融合蛋白和肿瘤细胞的亲和力; ADCC(抗体介导的细胞毒实验)测定融合蛋白对肿瘤细胞体外杀伤作用;利用接种肺腺癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究。结果:通过重组质粒转染至293F细胞的方法,sc Fv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中;免疫组化和流式结果显示,融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞有较强的结合能力; ADCC实验结果示融合蛋白在体外对肿瘤细胞的杀伤作用;荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用,在5 mg/kg的药物剂量下,荷瘤小鼠瘤体体积平均增长率从14. 90%降低至3. 72%,两独立样本t检验P<0. 05,差异具有统计学意义。结论:成功制备了含单链抗体的融合蛋白,其对A549细胞具有良好的结合能力,在体内外均对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用,为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据。

快速大容量尾静脉注射法建立肝细胞癌小鼠模型

目的:通过快速大容量尾静脉注射法建立肝细胞癌小鼠模型。方法:采用快速大容量尾静脉注射法,将插入NRAS基因的NRASV12转座子质粒、表达myr-Akt基因转座子质粒以及转座酶SB100的混合盐溶液通过小鼠尾静脉大容量(2 m L)、短时间(7 s)进行注射,作为观察组;同时设置对照组,同样方法注射等量0. 9%氯化钠注射液。注射3～4周后,处死观察组及对照组小鼠,通过病理学检查小鼠成瘤情况。结果:观察组小鼠成瘤率100%(24/24),经病理学检测为肝细胞癌;对照组小鼠无成瘤。结论:快速大容量尾静脉注射方法构建肝细胞癌小鼠模型方法简单,诱癌时间短,成功率高,重复性好。

水流动力学注射方法建立肝内胆管癌动物模型

目的 建立一种小鼠肝内胆管癌动物模型。方法 采用水流动力学注射方法将表达Notch1基因胞内区活性形式pT3-EF1a-Notch1分子的胞内结构域（NICD1）转座子和表达myr-蛋白激酶B（Akt）基因转座子质粒溶液通过小鼠尾静脉注射至肝脏。注射生理盐水作为对照。注射4周后处死，病理学检查肿瘤发生情况，免疫组织化学、免疫荧光检测细胞角蛋白19（CK19）及标签蛋白流感病毒血凝素蛋白表面抗原决定簇衍生的蛋白标签序列（HA）标记的Akt表达。结果 实验组小鼠均形成肿瘤，成癌率为100%（14/14）；病理学检测为胆管细胞性肝癌，免疫组织化学检测CK19，14例中有9例强阳性表达（64.3%），证实瘤细胞是胆管细胞性肝癌。同样，在瘤细胞中检测到HA强阳性表达率为42.9%（6/14）；免疫荧光双标记CK19和HA升高。 结论 水流动力学注射方法成功构建肝内胆管癌小鼠模型且诱癌时间短，方法简单，重复性好。