基于OSMAC策略对淮河来源真菌Talaromyces stipitatus BMC-16化学成分多样性的研究

目的采用单菌株多次级代谢产物(OSMAC)策略对分离自安徽蚌埠淮河区域泥样的真菌Talaromyces stipitatus BMC-16进行化学多样性的研究。方法基于OSMAC策略,选用19种不同培养基分别小规模发酵培养菌株Talaromyces stipitatus BMC-16。观察不同培养基条件下菌株生长状态,采用高效液相色谱法(HPLC)和薄层色谱法(TLC)分析小规模发酵次级代谢产物化学多样性,纸片法检测其抑菌活性。结果在不同培养基中,菌株的产量、生长形态、代谢产物分布以及抑菌活性均有差异,显示出较佳的代谢潜能。对不同培养基发酵物中的主峰进行分离纯化,获得化合物1,经鉴定为已知化合物stipitatic acid。结论基于OSAMC策略,改变培养基条件,对菌株Talaromyces stipitatus BMC-16的次级代谢产物有显著的影响,丰富了该菌株次级代谢产物的化学多样性。

紫草素通过HSP90/PKM2/HIF-1α介导脂多糖诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎症反应

目的探讨紫草素对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的影响及其作用机制。方法采用LPS诱导RAW264.7细胞构建体外炎症模型,将细胞分为5组:空白组、LPS(20μg/ml)组和紫草素(0.8,1.4,2.0μmol/L)组。通过ELISA法检测紫草素对TNF-α、IL-6、IL-4和IL-10炎症因子分泌和生成的影响;免疫荧光法和Western blot法检测各组细胞M1型标志蛋白(iNOS)、M2型标志蛋白(Arg-1)表达水平;Western blot法检测各组细胞中糖酵解相关蛋白HSP90、PKM2和HIF-1α蛋白表达水平;采用试剂盒检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)和乳酸水平;免疫共沉淀实验(CO-IP)检测各组细胞中HSP90、PKM2、HIF-1α蛋白之间相互作用。结果ELISA实验结果显示,与空白组相比,LPS组M1型相关因子TNF-α、IL-6分泌增多(P<0.05),M2型相关因子IL-10、IL-4分泌减少(P<0.05);而相比于LPS组,紫草素组M1型相关因子TNF-α、IL-6分泌降低(P<0.05),M2型相关因子IL-10、IL-4分泌上升(P<0.05),且与紫草素浓度呈剂量依赖性。免疫荧光和Western blot结果显示,与空白组相比,LPS组iNOS蛋白表达量和荧光强度增加(P<0.01);而与LPS组相比,紫草素组蛋白表达和荧光强度降低(P<0.001),Arg-1的表达趋势与iNOS相反(P<0.001)。与空白组相比,LPS组ATP和乳酸的释放增加,而与LPS组相比,紫草素组ATP和乳酸释放减少。与空白组相比,LPS组HIF-1α和PKM2表达显著增加(P<0.001),而与LPS组相比,紫草素组HIF-1α和PKM2表达呈剂量依赖性降低(P<0.001),但HSP90无明显变化,CO-IP实验表明紫草素破坏了HIF-1α与HSP90之间的相互作用。结论紫草素可调节LPS刺激的RAW264.7细胞M1/M2极化,改变M1和M2型巨噬细胞标记物水平,并通过破坏HSP90/PKM2/HIF-1α信号通路间相互作用,保护RAW264.7细胞减轻LPS诱导炎症反应,从而影响炎症的进展。

淡水真菌Acremonium tubakii BMC-58产多肽cephaibol A的发酵工艺及抗菌活性

目的 改良淡水真菌Acremonium tubakii BMC-58产多肽cephaibol A的发酵工艺,提高其产率并检测其抗菌活性。方法 通过对6种培养基的筛选确定基础培养基后,采用单因素实验研究接种量、培养温度、摇床转速、培养时间、初始pH、碳源、氮源和无机盐对菌株BMC-58产cephaibol A产率的影响,确定最适的培养条件;接下来采用Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面试验优化培养基成分;最后通过纸片法检测cephaibol A对4种细菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA;Staphylococcus aureus,S.aureus;Bacillus subtilis,B.subtilis;Mycobacterium phlei,M.phlei)的抗菌活性。结果 确定了菌株BMC-58在真菌2号培养基中产多肽cephaibol A的产率最高,并将培养基成分调整为蛋白胨、酵母浸膏、玉米淀粉、可溶性淀粉、MgSO_(4)、CaCO_(3)、谷氨酸钠和甘露醇,培养条件为菌株接种量2%,培养基初始pH6.0,培养温度28℃,摇床转速180 r/min以及培养时间7 d,最终cephaibol A的产率(17.23 mg/L)比优化前(8.7 mg/L)提高了1.97倍。同时抗菌实验中cephaibol A对MRSA抗菌活性较好,抑菌圈为9.0 mm。结论 通过优化培养条件后,cephaibol A的产率具有一定的提高,对检测的4种细菌也都有较好的抗菌活性,是一种潜在的抗耐药菌药物。

硫酸氨基葡萄糖脂质体的制备及其对骨关节炎的治疗作用

目的:构建与评价硫酸氨基葡萄糖脂质体(glucosamine sulfate liposome,GAS-Lips),并比较游离硫酸氨基葡萄糖(GAS)和GAS-Lips对前交叉韧带横断术(anterior cruciate ligament transection,ACLT)构建的骨关节炎大鼠的治疗效果。方法:采用薄膜分散法构建GAS-Lips,并对其粒径、形貌、载药量与体内滞留性进行评价。24只SD大鼠随机分为假手术组、ACLT+未给药组、ACLT+GAS组、ACLT+GAS-Lips组。通过关节腔注射生理盐水、GAS与GAS-Lips进行体内药效实验,并观察其对骨关节炎的治疗作用。结果:表征实验结果表明,GAS-Lips平均粒径为(255.02±3.64)nm,形状为类球形。制剂学评价结果表明,包封率为(78.62±1.01)%,载药量为(9.90±0.75)%,并具有良好的缓释作用。体内滞留实验表明,与对照组相比,Cy3-Lips组在关节腔滞留时间明显延长(P<0.01)。体内药效实验表明,与游离GAS相比,GAS-Lips可以更有效缓解关节表面损伤,抑制炎症因子的表达(P均<0.01),且对大鼠的体重无明显影响。结论:本研究成功构建与评价了一种GAS-Lips,提高了GAS在骨关节炎滞留时间与治疗效果,为其开发成为骨关节炎纳米制剂提供研究基础。

癌细胞膜伪装的纳米递药系统的初步构建与评价

目的制备肺癌细胞膜(lung cancer cell membrane,CM)包裹的仿生纳米靶向载体,并对其进行评价。方法通过一锅包封法将槲皮素(quercetin,QT)载入沸石咪唑骨架(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8),得到纳米药物(zeolitic imidazolate framework-8@quercetin,ZIF-8@QT)。将A549细胞膜与二硬脂酰基乙醇胺(distearoyl phosphoethanolamine,DSPE)混合,并与ZIF-8@QT通过水浴超声法包裹到纳米药物上,完成仿生纳药物(lung cancer cell membrane-distearoyl phosphoethanolamine-zeolitic imidazolate framework-8@quercetin,CMD-ZIF-8@QT)的构建。对CMD-ZIF-8@QT的粒径、形貌、稳定性、封装效率、体外释药性进行评价,并进行体内分布与药效实验。结果表征实验结果显示CMD-ZIF-8@QT的平均粒径为(176.4±2.72)nm,形状为类球形。制剂学评价表明仿生纳米药物载药量为16.8%±0.64%,包封率为84.2%±1.42%,且具有良好的酸敏感性和稳定性。体内分布实验结果表明,与Cy5组相比,Cy5-CMD-ZIF-8组仿生纳米载体在体内富集到肿瘤部位(P<0.01)。体内药效实验结果表明,与QT相比,载QT的仿生载体在体内具有更突出的治疗效果(P<0.01)。结论本研究成功制备了一种仿生纳米药物,提高了药物对肿瘤的靶向性与治疗效果,降低了槲皮素的副作用,提高了用药安全性。

C57BL/6小鼠关节软骨细胞的提取及凋亡模型的建立

目的体外培养C57BL/6小鼠关节软骨细胞,建立符合骨关节炎实验需求的凋亡模型。方法采用两步酶消化配合机械吹打法分离C57BL/6小鼠关节软骨细胞,倒置相差显微镜分别观察5代软骨细胞的形态及生长情况,甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定软骨细胞,CCK-8法分别检测5代软骨细胞的活力情况,实时荧光定量(RT-PCR)法分别检测5代软骨细胞中Ⅱ型胶原mRNA的变化。在培养基中加入不同浓度(0,5,10,20μmol/L)的星形孢菌素及200μmol/L H_(2)O_(2)作用24 h,通过检测细胞凋亡率,选择合适的浓度,并利用AOEB法进一步验证10μmol/L星形孢菌素的促凋亡作用。结果体外培养的C57BL/6小鼠关节软骨细胞,第1代类圆形,第2代三角形,第3代三角形及短梭形,3代后软骨细胞主要呈长梭形且形态不规则,胞核增大,胞质边缘模糊化。经甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫荧光染色证实为软骨细胞。与第1代软骨细胞相比,第4代和第5代软骨细胞的细胞活力显著降低(均P<0.05)。与第1代软骨细胞相比,第4代和第5代软骨细胞的Ⅱ型胶原mRNA相对表达量显著降低(均P<0.001)。与H_(2)O_(2)阳性对照相比,10μmol/L星形孢菌素作用软骨细胞24 h凋亡率为(63.97±1.67)%,差异无统计学意义。AOEB结果显示,与正常细胞相比,10μmol/L星形孢菌素作用软骨细胞后,凋亡早期细胞核质体呈绿色,细胞形状不规则;凋亡晚期细胞,核质体呈橙色,细胞核碎裂成点状,大小不一。结论本研究成功培养了C57BL/6小鼠关节软骨细胞,10μmol/L星形孢菌素作用3代内软骨细胞24 h建立凋亡模型最适宜。

夹竹桃活性内生真菌的分离筛选及菌株Aspergillus sp.次级代谢产物的研究

目的从夹竹桃中分离、筛选活性内生真菌,对其中一株次级代谢产物进行分离鉴定及活性评价,以获得活性化合物。方法采用平板涂布法和划线法培养分离夹竹桃内生真菌,MTT法筛选活性菌株,确定目标菌株并大量发酵。通过硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱方法分离纯化菌株乙酸乙酯粗提物中的次级代谢产物。利用波谱学方法及与文献对照解析化合物结构,并进行细胞毒活性测试。结果从夹竹桃不同部位中共分离得到18株内生真菌,其中Aspergillus sp.10-4显示出对人非小细胞腺癌细胞(H1975)明显的细胞毒活性。于其乙酸乙酯粗提物中分离得到2个化合物,结构鉴定为5-甲氧基柄曲霉素和(+)-sydonic acid。结论首次从夹竹桃内生真菌中分离得到5-甲氧基柄曲霉素,表明夹竹桃内生真菌具有产生结构多样次级代谢产物的潜在能力。