外源性瘦素通过上调星形胶质细胞GLT-1和GLAST的表达减轻小鼠脑缺血再灌注引起的谷氨酸兴奋毒性损伤

目的 探究外源性瘦素(Leptin)对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其内在机制。方法 将100只C57BL/6小鼠随机分为5组:假手术(Sham)组、脑缺血/再灌注模型组(I/R组)、瘦素低剂量组(Leptin-L组,0.5 mg/kg)、瘦素中剂量组(LeptinM组,1 mg/kg)和瘦素高剂量组(Leptin-H组,2 mg/kg),20只/组。采用改良线栓法复制小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型,缺血1.5 h再灌注24 h后进行神经功能评分评估神经功能缺损程度,TTC染色测定脑梗死面积,HE染色观察皮层脑组织病理变化,退化神经元染色观察皮层神经元变性损伤程度,免疫组织化学染色测定皮层脑组织胶原酸性纤维蛋白的表达和形态变化,Western blot测定皮层脑组织胶原酸性纤维蛋白蛋白表达。在此基础上,另将45只C57BL/6小鼠随机分为Sham组、I/R组和Leptin组(1 mg/kg),15只/组。谷氨酸检测试剂盒检测皮层脑组织谷氨酸含量,免疫组织化学染色测定皮层谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)和谷氨酸转运体1(GLT-1)表达,Western blotting测定GLAST、GLT-1蛋白表达。结果 与I/R组比较,瘦素明显降低小鼠神经功能缺损评分(P<0.0001),缩小脑梗死面积(P<0.001),减轻皮层脑组织病理损伤程度,降低皮层神经元损伤程度(P<0.0001),维持星形胶质细胞正常形态及降低星形胶质细胞的过度增生和表达(P<0.01),使GLT-1、GLAST表达上调(P<0.01、P<0.05),脑组织谷氨酸含量降低(P<0.01)。结论 外源性瘦素对小鼠脑缺血再灌注损伤具有明显的神经保护作用,其机制可能与调节星形胶质细胞过度增生和上调GLT-1、GLAST的表达从而降低谷氨酸的兴奋毒性损伤有关。

类风湿关节炎的潜在生物标志物及其免疫调控机制:基于GEO数据库

目的 探讨类风湿关节炎(RA)的潜在发病机制,挖掘可以作为RA早期诊断的生物标志物,并探究其可能的免疫调控机制。方法 依托GEO数据库多个基因组数据,利用limma包、RRA方法、批次矫正方法与clusterProfiler包筛选差异表达基因并预测其作用功能;通过STRING在线数据库得到蛋白质互作网络,利用Cytoscape3.8.0软件与GeneMANIA数据库筛选差异表达关键基因并预测其互作机制;构建ROC工作曲线验证关键基因诊断模型的信效度,并通过机器学习方法筛选疾病特征免疫细胞;使用corrplot包分析特征免疫细胞与疾病关键基因的相关性;使用GSEA富集方法探究关键基因生物学功能和相关性;通过构建胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型探究具有较高诊断价值的差异基因在RA滑膜组织中的表达情况。结果 得到与RA密切相关核心关键基因9个,分别为:CD3G、CD8A、SYK、LCK、IL2RG、STAT1、CCR5、ITGB2、ITGAL,富集分析结果表明差异基因可能主要通过细胞因子相关通路调控滑膜炎症;ROC工作曲线分析表明9个核心基因的预测模型信效度较高,其中STAT1预测模型的AUC值最高(0.909);相关性分析结果显示,CD3G、ITGAL、LCK、CD8A和STAT1等5个核心基因与疾病特征免疫细胞相关性较强,其中STAT1与M1型巨噬细胞的相关性联系最强(R=0.68,P<0.001);CIA大鼠膝关节的HE、番红-O固绿染色结果表明关节炎大鼠造模成功且药物治疗有效,免疫荧光结果表明STAT1和磷酸化的STAT1在CIA大鼠踝关节滑膜组织中表达高于正常组和治疗组;免疫印迹实验结果表明,STAT1蛋白表达量在滑膜成纤维细胞的细胞核(P=0.0002)与细胞质(P<0.0001)中存在差异,且经过治疗,细胞核内p-STAT1与STAT1的蛋白表达量显著降低(P<0.0001)。结论 CD3G、CD8A、SYK、LCK、IL2RG、STAT1、CCR5、ITGB2与ITGAL等9个基因可作为RA的早期诊断生物标志物,CD3G/CD8A/LCK-γδ T细胞、ITGAL-Tfh细胞、STAT1-M1型巨噬细胞等基因-免疫细胞途径可能与RA的发生发展密切相关。

大豆异黄酮通过抑制Wnt/Ca2+信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注引起的钙超载

目的 探讨大豆异黄酮(SI)减轻脑缺血再灌注(I/R)引起钙超载的作用机制。方法 将48只SD大鼠采用随机数法分为4组:假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注模型组(I/R组)、病毒空载组(NC组)、Frizzled-2敲低组(Knock down组),12只/组。采用线栓法堵塞大脑中动脉2 h,再灌注24 h构建I/R模型。采用Western blot验证病毒敲低效率并检测Wnt/Ca2+信号通路相关蛋白Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ的变化。采用钙含量显色法检测各组缺血半暗带(IP)区钙离子浓度变化,HE检测各组IP区组织结构变化。另将72只SD大鼠采用随机数法分为3组:Sham组、I/R组、大豆异黄酮预处理组(SI组),24只/组。采用多普勒血流仪检测局部脑血流变化,TTC染色检测脑梗死体积,HE和尼氏染色检测IP区组织变化、免疫荧光检测ROS、Ca2+和细胞凋亡水平、流式检测细胞钙离子浓度,试剂盒检测血清MDA和SOD水平,Western blotting和免疫组化检测IP区Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ蛋白表达。结果 与I/R组比较,Knock down组钙离子浓度(P<0.001)、Wnt5a(P<0.05)、Frizzled-2(P<0.05)和P-CaMKⅡ(P<0.001)表达水平均降低;与I/R组比较,SI组钙离子浓度(P<0.05)、ROS和MDA水平(P<0.001)、细胞凋亡程度(P<0.001)、脑梗死体积(P<0.001)、Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ表达水平(P<0.05)均降低,SOD水平升高(P<0.001)。结论大豆异黄酮可能通过抑制Wnt/Ca2+信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注引起的钙超载。

氧糖剥夺再灌注对神经元Wnt5a/FZD2/Ca^(2+)通路的影响

目的:探讨氧糖剥夺再灌注(OGD/Rep)后神经元细胞内Wnt5a/FZD2/Ca^(2+)通路的变化。方法:采用OGD/Rep模型构建神经元细胞局部缺血/再灌注损伤,分正常组、再灌注(0、3、6、9、12、24 h)组。免疫荧光鉴定皮层神经元细胞,CCK-8法确定神经元细胞OGD时间,Western blotting检测非经典Wnt/Ca^(2+)信号通路中Wnt5a、FZD2、IP3-R和p-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白的变化,免疫荧光和酶标仪检测细胞内Ca^(2+)和活性氧(ROS)的含量。结果:MAP-2免疫荧光鉴定原代皮层神经元细胞纯度较高。与正常组比较,神经元细胞OGD 3 h后细胞存活率为55.46%;与正常组比较,OGD/Rep后非经典Wnt/Ca^(2+)信号通路相关蛋白Wnt5a(3、6、9、12、24 h)、FZD2(3、6、9 h)、IP3-R(6、9、12、24 h)和p-CaMKⅡ/CaMKⅡ(6 h)的相对表达量上调(P<0.05~P<0.01);与正常组比较,OGD/Rep后神经细胞内Ca^(2+)和ROS的表达量均升高(P<0.01)。结论:神经元细胞OGD/Rep能激活Wnt5a/FZD2/Ca^(2+)信号通路。

脂多糖刺激人乳腺上皮细胞SYK及炎症因子的表达变化

目的:探讨脂多糖(LPS)刺激人乳腺上皮细胞中脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)表达变化及对炎症因子分泌的影响。方法:不同浓度LPS诱导人乳腺上皮细胞产生炎症反应,制备急性乳腺炎细胞模型;通过CCK-8法检测细胞增殖活性;采用实时荧光定量PCR技术确定LPS最适刺激时间、浓度及该条件下SYK、炎症因子mRNA表达水平;免疫荧光法检测LPS刺激人乳腺上皮细胞后SYK蛋白表达的变化。结果:CCK-8结果显示,25μg/mL LPS刺激1 h,人乳腺上皮细胞增殖活性无明显变化(P>0.05);实时荧光定量PCR结果显示,25μg/mL LPS刺激1 h后乳腺上皮细胞SYK基因表达最显著(P<0.05);LPS刺激后,白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α和NLRP3表均增高(P<0.05),siRNA敲低SYK基因后,IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α和NLRP3表达均降低(P<0.05)。结论:抑制SYK基因可减少LPS诱导的乳腺炎细胞模型炎症因子释放,对于乳腺上皮细胞具有一定保护作用。