樱黄素抑制TLR4/MyD88通路减轻肠上皮炎症反应改善小鼠克罗恩病样结肠炎

目的探讨天然植物化合物樱黄素(PRU)对肠上皮细胞炎症和屏障结构的作用及其对小鼠克罗恩病样结肠炎的影响。方法建立脂多糖(LPS)诱导的结肠类器官炎症损伤模型和2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(TNBS)诱导的小鼠结肠炎模型,用于评估PRU对肠上皮炎症反应和肠屏障的影响。另外,使用网络药理学结合体内外研究分析PRU调控肠上皮炎症影响肠炎的分子机制。结果PRU干预可抑制LPS诱导的结肠类器官中促炎介质肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β的释放以及改善TNBS诱导的小鼠结肠炎症状(体质量下降、疾病活动指数和炎症评分升高);同时,PRU促进LPS诱导的小鼠结肠类器官TNBS小鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白闭锁小带蛋白1(ZO-1),密封蛋白1(claudin-1)的表达和改善移位,同时保护肠屏障结构。PRU可靶向结合Toll样受体4(TLR4)并抑制TLR4/髓样分化因子88(MyD88)信号通路活化。结论PRU可通过靶向拮抗TLR4/MyD88信号的激活,抑制肠上皮细胞炎症和保护肠屏障损伤从而改善克罗病样肠炎。

前列腺素D2调控自噬影响胃癌干细胞的干性

目的:探究前列腺素D2(Prostaglandins D2,PGD2)对胃癌干细胞(gastric cancer stem cells,GCSCs)干性的影响及机制。方法:通过无血清培养法富集7901‐GCSCs;然后通过流式细胞术检测无血清培养的7901‐GCSCs干性标志物CD44的阳性率;通过干细胞成球实验检测不同浓度PGD2(2.5、5、10)μg/mL刺激后的成球能力,并采用Western blot实验检测不同浓度PGD2刺激后干性相关指标(OCT4、CD44)和自噬相关蛋白(LC3、Beclin‐1)的表达。采用Western blot实验检测不同浓度CQ(2.5、5、10)μmol/L刺激后自噬相关蛋白的表达。通过Western blot实验检测PGD2以及PGD2+CQ处理后自噬相关蛋白(LC3、Beclin‐1)和干性相关指标(OCT4、CD44)的蛋白表达。结果:流式细胞术结果显示,与胃癌细胞SGC‐7901相比,无血清培养的7901‐GCSCs中CD44阳性率表达增加(P<0.05)。干细胞成球实验结果表明,与DMSO组相比,PGD2组中7901‐GCSCs的成球能力明显减弱(P<0.05)。Western blot结果显示,与DMSO组相比,PGD2组中7901‐GCSCs的干性相关指标(OCT4、CD44)蛋白表达下调(P<0.05),而自噬相关蛋白(LC3、Beclin‐1)表达增加(P<0.05)。与DMSO组相比,CQ组中自噬相关蛋白(LC3、Beclin‐1)表达降低(P<0.05)。Western blot结果还显示,与DMSO组相比,PGD2+CQ组中细胞自噬相关蛋白以及干性相关指标表达并无明显变化,提示CQ可阻断PGD2对7901‐GCSCs的干性抑制作用。结论:PGD2可能通过调控自噬影响7901‐GCSCs的干性。

上调KLF11可改善结肠炎模型小鼠的肠道炎症:基于抑制JAK2/STAT3信号通路

目的分析Kruppel样转录因子11(KLF11)在克罗恩病(CD)肠黏膜组织中的表达情况,并探究其对CD样结肠炎的作用和机制。方法以本院收集的CD患者结肠标本为实验组(CD,n=12),CRC患者结肠标本为对照组(Control,n=12),分析KLF11在病变和正常结肠黏膜组织中的表达差异;构建TNBS诱导的小鼠模型,分析KLF11在小鼠结肠黏膜组织中的表达情况;利用腺相关病毒感染上调KLF11在小鼠中的表达,并观察其对小鼠CD样结肠炎的影响;通过慢病毒感染构建Caco-2细胞KLF11高表达稳定体系,并利用体内外免疫印迹实验探究KLF11对JAK2/STAT3信号通路蛋白的影响;采用信号通路激动剂处理KLF11表达上调的小鼠,验证肠道炎症反应的相关机制。结果免疫荧光染色分析显示,病变肠黏膜组织中KLF11表达水平较低(P<0.05),而TNBS小鼠结肠标本KLF11表达水平同样较低(P<0.05);通过腺相关病毒感染小鼠发现,上调KLF11能够改善TNBS小鼠肠炎症症状,并降低肠黏膜炎症因子的表达水平(P<0.05);利用慢病毒感染Caco-2细胞,通过免疫印迹筛选KLF11稳定高表达的细胞株(P<0.05);体内外免疫印迹实验均显示,上调KLF11抑制了小鼠肠黏膜组织及Caco-2细胞中p-JAK2和p-STAT3的表达水平;经JAK2/STAT3激活剂香豆霉素A1(COU)干预后显示,上调KLF11未能改善小鼠肠道炎症,同时肠黏膜炎症因子表达水平增加(P<0.05)。结论KLF11在CD肠黏膜中低表达,上调KLF11能改善肠炎症状、减少炎症因子分泌,其可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路拮抗肠道炎症反应。

PCID2在胃癌组织中高表达并通过调控细胞周期进程和增殖影响患者预后

目的探讨扩增基因PCI结构域2(PCID2)在胃癌中的表达情况及其对细胞周期进程和增殖的影响,并分析其可能的分子机制。方法纳入2012年1月~2016年12月在我院接受胃癌根治术的患者100例,检测胃癌和癌旁组织中PCID2的表达差异;统计学分析PCID2表达水平对胃癌进展及术后5年生存率的影响;采用GO富集分析预测PCID2参与胃癌恶性进展的可能作用途径;体外采用慢病毒转染特异性敲低和过表达胃癌细胞系(MGC-803)中PCID2表达,并分析其对细胞增殖及周期的影响;进一步通过裸鼠移植瘤模型进行在体验证;最后通过组织样本分析结合体内外研究,分析PCID2影响胃癌细胞的分子机制。结果相较于癌旁组织,PCID2在胃癌组织中高表达(P<0.01);胃癌组织中PCID2表达水平与外周血中CA19-9及CEA水平呈正相关(P<0.001);以胃癌组织中PCID2相对表达水平(IOD值)的中位数(3.085)为界,将纳入研究的患者分为PCID2高表达组(n=50)和PCID2低表达组(n=50),PCID2高表达组患者术后5年生存率显著低于PCID2低表达组(P<0.001);单因素结合Cox多因素分析表明胃癌组织中PCID2高表达是影响患者术后5年生存率的独立危险因素(HR:2.987,95%CI:1.616-5.519);ROC曲线分析显示,以PCID2相对表达水平(3.035)为截点值,评估胃癌患者术后5年生存率的敏感性为76.74%,特异性为75.44%,曲线下面积为0.755(P<0.001)。GO功能富集分析提示PCID2可能与胃癌细胞周期进程有关(P<0.01)。体外实验证实,PCID2过表达可促进胃癌细胞增殖、G1/S期转变和细胞周期相关蛋白(CyclinD1、CDK6)的表达,而敲低则反之(P<0.05)。裸鼠成瘤实验证明,PCID2过表达可促进裸鼠移植瘤的生长,而敲低则抑制(P<0.05)。组织样本分析联合体内外研究表明,胃癌组织中p27、p16蛋白表达水平较癌旁组织均明显降低(P<0.05)。此外,PCID2过表达抑制细胞周期调控蛋白p27、p16的表达,敲低则相反(P<0.05)。结论PCID2在胃癌组织中高表达且与患者预后不良密切相关,其可能通过抑制p27、p16表达促进胃癌细胞增殖和细胞周期进程。

miR-199a-5p通过靶向TGF-β2参与调节肝纤维化进程

目的:探讨miR-199a-5p在肝硬化发生中的作用机制。方法:通过设计合成miR-199a-5p mimics和miR-199a-5p inhibitor序列,对miR-199a-5p进行过表达和抑制研究,利用CCK8、5EdU、Western blotting等方法检测过表达miR-199a-5p对Lx-2细胞增殖活性的影响。以Lx-2细胞cDNA为模板,分别利用TGF-β23′UTR的野生型引物序列与miR-199a-5p潜在结合位点突变引物序列进行PCR扩增,获得野生型TGF-β23′UTR序列和突变型TGF-β23′UTR序列,并通过双荧光报告基因实验揭示TGF-β表达的调控过程。结果:体外实验结果显示,Lx-2细胞转染miR-199a-5p mimics后8、12、24 h,细胞活性均较对照组增加(P<0.05~P<0.01),α-SMA蛋白表达水平较对照组提高(P<0.05);Lx-2细胞转染miR-199a-5p inhibitor后8、12、24 h,细胞活性均较对照组降低(P<0.05~P<0.01),α-SMA表达水平亦较对照组下降(P<0.05)。双荧光素酶试验显示,与对照组相比,转染miR-199a-5p mimics后,包含野生型TGF-β23′UTR序列(WT)的荧光素酶质粒表达明显降低(P<0.01),而包含miR-199a-5p结合位点突变序列(MUT)的荧光素酶质粒表达无明显变化(P>0.05)。结论:上调miR-199a-5p表达可促进Lx-2细胞系增殖,同时,miR-199a过表达可促进细胞基质蛋白α-SMA表达,激活Lx-2向纤维化方向发展。miR-199a-5p在肝硬化进程中起促进肝纤维化和肝硬化作用,TGF-β2作为肝纤维化的主要调控因子之一,miR-199a-5p通过调控下游TGF-β2的表达,实现对肝纤维化和肝硬化的促进作用。

紫菀酮通过抑制肠上皮细胞凋亡改善TNBS诱导的克罗恩病样结肠炎

目的研究紫菀酮(SHI)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠克罗恩病(CD)样结肠炎的作用及潜在机制。方法18只野生型小鼠随机分为3组:对照组(WT组)、模型组(TNBS组)和SHI干预组(SHI组),每组6只。TNBS组小鼠肛门推注5%TNBS诱导CD样结肠炎;SHI组在TNBS造模的同时给予SHI灌胃干预[40 mg/(kg·d)],WT组和TNBS组每日给予等量的生理盐水灌胃。1周后处死小鼠,采用疾病活动度(DAI)评分、体质量改变、结肠长度、组织学炎症评分和小鼠结肠黏膜肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平评估肠炎程度。采用荧光素异硫氰酸酯-右旋糖酐(FITC)渗透性测定、肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)测定、细菌移位率评估肠屏障功能。通过TUNEL染色检测小鼠肠上皮细胞凋亡情况;通过Western blot检测小鼠凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达量。采用网络药理学以及生信富集分析预测SHI干预对小鼠CD样结肠炎保护作用的可能途径。结果与WT组比较,TNBS组DAI评分、体质量降低幅度、组织学炎症评分和结肠黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05);与TNBS组比较,SHI组DAI评分、体质量降低幅度、组织学炎症评分和结肠黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低(P<0.05)。与WT组比较,TNBS组小鼠结肠长度缩短(P<0.05);与TNBS组比较,SHI组小鼠结肠长度增加(P<0.05)。网络药理学以及生信富集分析发现SHI可能通过拮抗肠上皮细胞凋亡治疗CD。与TNBS组比较,SHI组小鼠外周血FITC-dextran、I-FABP水平和肝脏、肠系膜淋巴结的细菌移位率较低(P<0.05)。TUNEL染色结果显示,与TNBS组比较,SHI组小鼠结肠组织中肠上皮细胞凋亡数量显著减少(P<0.05),Bax的表达下调,Bcl-2的表达上调(均P<0.05)。结论SHI可能通过抑制肠上皮细胞凋亡进而缓解TNBS诱导的小鼠CD样结肠炎。

系统性红斑狼疮患者外周血CD19^(+)CD25^(+)Breg比例和细胞表面PD-1和PD-L1的表达及其与临床指标的相关性

目的 研究程序性死亡蛋白1(PD-1)与其配体PD-L1在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD19^(+)CD25^(+)调节性B细胞(Breg)的表达及临床意义。方法收集50例SLE患者和41例健康人(HC)外周血标本,采用流式细胞仪检测外周血中CD19^(+)CD25^(+)Breg的比例,以及CD19^(+)CD25^(+)Breg的PD-1、PD-L1表达,同时采集患者的临床表现和实验室指标等临床信息。使用免疫磁珠分选CD4^(+)T细胞与CD19^(+)B细胞,体外细胞共培养,检测Breg的分化。结果SLE患者活动组外周血中CD19^(+)CD25^(+)Breg比例低于HC,CD25^(+)B细胞PD-1、PD-L1的表达高于HC;SLE患者有胸腔积液、关节炎、C反应蛋白(CRP)上升的患者Breg频率高于对应阴性组;SLE患者有IgM下降、抗核糖核蛋白(RNP)抗体阳性的患者Breg频率低于对应阴性组;SLE患者有感染、发热、关节炎、IgA上升的患者CD19^(+)CD25^(+)PD-1^(+)细胞频率高于对应阴性组;SLE患者有感染、发热、IgA上升的患者CD19^(+)CD25^(+)PD-L1^(+)细胞频率高于对应阴性组;活化的CD4^(+)T细胞有利于CD19^(+)B细胞表面CD25的表达。结论SLE患者外周血中CD19^(+)CD25^(+)Breg降低,但细胞表面PD-1与PD-L1的表达增加,并且与相关临床表现及实验室参数存在一定的关系。活化的CD4^(+)T细胞促进Breg的分化。

人工智能在生物化学与分子生物学教学中的运用及探讨

人工智能(artificial intelligence,AI)是用于辅助和扩展人类部分智能活动的一门新技术,是对人脑组织结构和思维机制的模仿。将人工智能技术理念应用于生物化学与分子生物学课程教学是一种有益的教学探讨,为传统教学赋以现代先进科学技术辅助,有助于培养更具前瞻性、实践能力和创新意识的医学人才。

基于微信平台的翻转课堂教学模式在临床微生物检验实习教学中的应用

目的评价基于微信平台的翻转课堂教学模式应用于临床微生物检验实习教学的效果。方法选取2021年蚌埠医学院第一附属医院检验科微生物实验室共31名实习生,作为对照组,采用传统教学模式;2022年蚌埠医学院第一附属医院检验科微生物实验室实习生共32名,作为观察组,采用基于微信平台的翻转课堂教学模式。比较两组实习生进岗前、实习结束后理论及实验技能的考核成绩,测评量表调查两组实习生综合能力及教学满意度。结果观察组和对照组进岗前的理论考核及实验技能成绩均无统计学差异(P>0.05)。实习结束后,观察组实习生理论成绩和实验技能成绩均高于对照组(86.56±3.52 vs 80.81±3.51,P<0.01),(89.88±3.19 vs 79.89±3.42,P<0.01),差异有统计学意义。观察组实习生的综合能力以及教学满意度均显著高于对照组(P<0.01)。结论临床微生物检验实习教学应用基于微信平台的翻转课堂教学模式能够有效改善实习教学质量,提高学生综合能力,提升学习效果,值得推广。

改进型“瑞士卷”法在小鼠肠道组织切片中的应用

目的为提高小鼠肠管组织石蜡切片的整体质量,探讨一种改进型“瑞士卷”法在肠道组织病理切片中的应用。方法分别采用常规“瑞士卷”制作方法和改进型“瑞士卷”法脱水包埋小鼠回肠、结直肠组织样本,制成组织切片。HE染色用于评估组织切片整体形态质量、组织器械性损伤及黏膜下层与肌层分离的情况;免疫组织化学染色LYVE-1标记淋巴管、染色CD31标记血管,分析黏膜下层结构完整性;采用免疫荧光染色对小鼠回肠潘氏细胞(溶菌酶阳性)及结直肠杯状细胞(MUC2阳性)予以标记。结果HE染色显示改进型“瑞士卷”组小鼠肠管组织切片整体形态及外观更加规整,组织未发生器械性损伤,且极少见黏膜下层与肌层分离的现象;免疫组织化学结果显示,改进型“瑞士卷”组小鼠肠管组织切片黏膜下层多见完整的淋巴管和血管结构,计数其黏膜下层完整淋巴管和血管的数量分别为(701.0±46.7)条和(881.6±58.7)条,显著高于常规方法组(149.5±23.6)条和(122.9±20.2)条(P<0.05);免疫荧光发现,改进型“瑞士卷”组小鼠回肠潘氏细胞及结直肠杯状细胞定位准确,极少见细胞结构缺失的情况。结论改进型“瑞士卷”法保护全层和全段肠管的完整性,减少操作带来的组织损伤,改善黏膜下层和肌层分离的现象,为小鼠肠道疾病的研究提供了一种更为可靠的技术。

N、N%、NLR、NAR对溃疡性结肠炎诊断和疾病活动度的预测价值

目的探讨中性粒细胞计数(N)、中性粒细胞百分比(N%)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、中性粒细胞与白蛋白比值(NAR)在溃疡性结肠炎(UC)患者病情评估中的应用价值。方法收集2022年5月至2023年7月就诊于该院的UC患者87例作为UC组,另选取同期该院的体检健康者42例作为对照组。收集研究对象血常规、生化常规相关炎症指标包括淋巴细胞计数(L)、N、淋巴细胞百分比(L%)、N%、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、白蛋白(ALB),计算NLR、NAR;收集研究对象相关临床资料,根据病史、改良Mayo评分系统、蒙特利尔分型标准分别对UC患者进行临床类型、疾病活动度、病变范围分组。评估N、N%、NLR、NAR 4个指标在对照组和UC组及UC不同亚组间的水平差异,采用Spearman相关分析4个指标与ESR和CRP的相关性,绘制受试者工作特征曲线,评估4个指标单独及联合检测UC患者时的诊断效能,并计算最佳临界值、灵敏度和特异度。结果UC组N、N%、NLR、NAR水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);N、N%、NLR、NAR水平在UC不同活动度、不同病变范围患者中比较,差异均有统计学意义(P<0.05);Spearman相关分析结果显示,UC患者中CRP水平与N、N%、NLR、NAR均呈正相关(r=0.392、0.343、0.354、0.503,P<0.001),ESR水平与N、NLR、NAR均呈正相关(r=0.383、0.233、0.475,P<0.05)。N、N%、NLR、NAR单独及联合诊断UC的曲线下面积分别为0.668、0.702、0.723、0.741、0.882,其中四者联合诊断的灵敏度和特异度较高(分别为80.5%和88.1%)。结论N、N%、NLR、NAR对UC患者的诊断、疾病活动度和病变范围的预测具有一定临床价值。

肝癌细胞来源的外泌体对其增殖、凋亡及自噬的生物学行为影响

目的外泌体在肝癌的发生发展中发挥重要作用,本研究旨在探讨HepG_(2)肝癌细胞增殖、凋亡及自噬与外泌体释放的影响及相关机制。方法通过超速离心法提取HepG_(2)细胞外泌体,采用透射电镜、纳米颗粒跟踪、Western blotting分析HepG_(2)细胞中外泌体形态、径粒分布及标志蛋白表达;将外泌体与HepG_(2)细胞共同培养以后,采用CCK-8检测HepG_(2)细胞增殖变化、流式细胞术检测HepG_(2)细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)和自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Beclin-1)表达。结果提取的HepG_(2)细胞外泌体形态符合外泌体特征,直径在30~150 nm之间,标志蛋白Alix和CD63表达明显。CCK-8结果显示,24 h外泌体组与对照组吸光度相比差异无统计学意义(P>0.05),48 h及72 h外泌体组吸光度均高于对照组(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,对照组细胞凋亡率为(14.96±0.28)%,外泌体组细胞凋亡率为(11.16±0.50)%,细胞凋亡率下降(t=11.485,P<0.001)。Western blotting结果显示,与对照组比较,外泌体组凋亡相关蛋白Bcl-2表达上调(P<0.01)、Bax表达下调(P<0.01),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达上调(P<0.01)、Beclin-1表达上调(P<0.05)、p62表达下调(P<0.01)。结论HepG_(2)细胞来源的外泌体可以促进细胞增殖,通过诱导自噬上调而抑制细胞凋亡。

胃癌组织中高表达ATP5A1与患者术后的不良预后和肿瘤细胞的糖代谢有关

目的分析ATP5A1在胃癌中的表达及对患者预后的影响,并探讨其调控肿瘤细胞糖代谢的作用机制。方法回顾性分析2013年2月~2016年11月在我院行胃癌根治术的115例患者,检测ATP5A1在胃癌组织中的表达情况并以IOD值中位数为界,将样本分为ATP5A1高表达组(n=58)和ATP5A1低表达组(n=57),分析其对患者术后远期预后的影响;慢病毒转染技术调控胃癌细胞系(MGC803)中ATP5A1基因的表达,并探究其对胃癌细胞糖代谢的影响及可能的分子机制;将裸鼠随机分成对照组、ATP5A1过表达组和低表达组(3只/组)。收集对照组、敲低和过表达ATP5A1基因的胃癌细胞悬液,分别接种到对应组裸鼠背部皮下,构建裸鼠移植瘤模型分析ATP5A1对肿瘤生长和糖代谢的影响。结果ATP5A1在胃癌组织中高表达(P<0.05),并与外周血CEA、CA19-9,病理分级、T分期及N分期密切相关(P<0.05);而高表达组患者术后5年生存率低(P<0.001),且ATP5A1高表达是影响胃癌患者术后生存期的独立危险因素(P<0.05);ROC曲线表明,ATP5A1高表达对患者预后具有预判价值(P<0.001)。过表达ATP5A1上调胃癌细胞对葡萄糖摄取和乳酸生成量以及糖代谢关键酶HK2、PFK1、LDHA的蛋白水平(P<0.05),而干扰ATP5A1则结果相反(P<0.05);在体实验表明,ATP5A1过表达增加胃癌细胞糖代谢(P<0.05),且促进肿瘤的生长(P<0.05)。高表达ATP5A1促进胃癌细胞中p-JNK和p-JUN的表达(P<0.05),且JNK抑制剂SP600125阻遏了过表达ATP5A1胃癌细胞糖代谢的促进作用(P<0.05)。结论胃癌组织中ATP5A1高表达并影响患者远期预后不良,且至少部分是通过JNK/JUN通路促进胃癌细胞的糖代谢。