广西眼镜蛇毒细胞毒素的分离及对人鼻咽癌等细胞抑制作用的研究

目的 探讨广西眼镜蛇毒细胞毒素对人鼻咽癌细胞(CNE)等多种癌细胞株的抑制作用。方法 经SephadexG 5 0 ,CM SepharoseCL 6B层析法从广西眼镜蛇毒中分离纯化获得细胞毒素 (CTX) ,采用MTT检测CTX对癌细胞株体外培养抑制作用 ,探索量效时效关系。结果 从广西眼镜蛇毒中分离到一种细胞毒素单一组分 (CTXCM 5 )对体外培养的人鼻咽癌细胞株 (CNE)、淋巴瘤细胞株 (YAC)、人宫颈癌细胞株 (HELA)和卵巢癌细胞株 (Ho8990 )的抑制有明显的剂量依赖关系 ,作用 48h的IC50 分别为 1 84,0 75 ,1 84和 2 5 9mg·L-1;随作用时间的延长 ,CTXCM 5对CNE细胞株作用最为明显 ,作用 3h和 2 4h的IC50 分别为 4 78和1 0 4mg·L-1。结论 CTXCM 5对体外培养的癌细胞株有较强的抑制作用。

中华眼镜蛇蛇毒组分C诱导白血病细胞凋亡作用的研究

研究眼镜蛇蛇毒组分Ｃ诱导白血病细胞凋亡的作用及机制。方法：应用光学显微镜、透射电镜、脱氧核糖核酸（ ＤＮＡ）电泳、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）等方法，观察白血病细胞经过眼镜蛇蛇毒组分Ｃ处理后，形态学、生物化学及ＢｃＩ－２／Ｂａｘ基因表达水平的变化。结果：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导人粒细胞白血病细胞系（ＨＬ６０）发生凋亡形态学和生物化学变化；流式细胞议分析发现眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能使一定比例的人粒单细胞白血病细胞系（Ｊ６－１）、人红白血病细胞系（Ｋ５６２）、ＨＬ６０。细胞及取自患者骨髓的白血病细胞发生凋亡，而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加；ＲＴ－ＰＣＲ方法检测发现眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能使ＨＬ６０细胞Ｂｃｌ－２基因的表达下调，而Ｂａｘ变化不明显。结论：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导白血病细胞发生凋亡，此作用与Ｂｃｌ－２基因的表达下调有关。

卵黄抗体用于蛇毒抗原检测的初步研究

目的在常规ELISA检测中,以卵黄抗体取代哺乳动物来源的IgG类抗体,以探讨卵黄抗体应用于蛇毒检测的可行性.方法以甲醛减毒的眼镜王蛇毒抗原免疫莱航母鸡,制备抗眼镜王蛇毒抗体;采用过碘酸钠法对特异卵黄抗体进行酶标;将卵黄抗体及相应酶标抗体应用于常规ELISA中,对国内常见蛇毒样品抗原(包括眼镜王蛇毒、眼镜蛇毒、金环蛇毒、银环蛇毒、五步蛇毒及广东园斑蝰蛇毒)进行检测,并进行灵敏度、精确度、特异性及交叉反应等分析.结果检测的灵敏度可达32 μg·L-1,并且眼镜王蛇毒抗原浓度在32～750 μg·L-1的范围内,线性关系较好(r=0.963);初步应用表明卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有较高的特异性,与蝰蛇科的五步蛇毒、园斑蝰蛇毒无交叉反应,与眼镜蛇科的金环及银环蛇毒仅在高剂量(剂量大于500 μg·L-1)时存在轻度交叉反应,不干扰实验检测,但与眼镜蛇毒之间交叉反应明显,干扰实验检测;应用本方法对低(100 μg·L-1)、中(300 μg·L-1)、高(1 000 μg·L-1)不同浓度的眼镜王蛇毒样品检测,结果平均板内变异系数均在1%～3%之内,板间变异系数在8%以内.结论 特异的卵黄抗体应用于微量蛇毒检测研究是可行的,具有灵敏度高、特异性较强等优点.该研究将为蛇伤诊断试剂盒的研制提供相应的理论依据.

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒 (Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶 (Non- hem onrrhagicfibrinolytic enzym e,NHFL E)并对其理化性质进行研究。方法 :应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFL E,用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力 ,用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定其相对分子质量 ,用皮内出血实验测定其出血活性。结果 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶 ,它的相对分子质量为 2 5 0 0 0 ,没有出血活性 ,在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白 ,相对活性为粗毒的 3.2倍。结论 :从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为 2 5 0 0 0的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性 。

眼镜王蛇毒L-氨基酸氧化酶诱导NACC细胞凋亡作用的研究

目的:研究眼镜王蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)诱导人类腭部小涎腺腺样囊性癌细胞系(NACC)细胞凋亡的作用。方法:采用倒置相差显微镜、H·E染色及透射电镜定性的方法,观察LAAO引起NACC细胞凋亡形态学改变,采用TUNEL半定量计算凋亡指数(AI)方法观察NACC细胞经不同浓度LAAO处理后引起细胞凋亡的情况。结果:倒置相差显微镜及H·E染色光镜观察、透射电镜观察可见典型细胞凋亡形态学改变,并可见凋亡小体形成。TUNEL半定量计算AI值,LAAO处理组与对照组比较差异有统计学意义(P<0·01),且AI值高低与LAAO浓度高低有关。结论:眼镜王蛇毒LAAO能诱导NACC细胞发生凋亡。

眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球制备及体外性质研究

目的研究眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin，CTX）聚乳酸／羟基乙酸缓释微球的制备方法，考察其一般性质、体外释药特性及生物学活性。方法采用色谱方法纯化眼镜蛇CTX，MTT方法检测细胞毒活性，复乳-溶剂挥发法制备载药微球，考察微球表面形态、粒径、包封率、载药率、体外释药行为及释放眼镜蛇CTX细胞毒活性。结果纯化眼镜蛇CTX具有明显的细胞毒作用，对肝癌HepG2细胞12，24h的IC50分别为1．43，1．12μg／mL，对L02肝细胞12，24h的IC50分别为1．37，1．01μg／mL。微球表面光滑圆整，粒径2．1～7．8μm，包封率和栽药率分别为（74．10±9．92）％和（0．72±0．09）％，30d药物累积释放84．3％，释放眼镜蛇CTX保持较好的生物学活性。结论采用复乳-溶剂挥发法可制备具有较高包封率，良好缓释效果，保持完整生物学活性的眼镜蛇CTX缓释微球。

蝮蛇毒血小板抑制因子对动脉血栓形成的影响及机制研究

目的:探讨皖南蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对家兔动脉血栓形成的影响及可能机制。方法:新西兰家兔24只,随机分成假手术组、动脉血栓模型组、阳性对照组(奥扎格雷钠,5mg/kg),AHV-PI(0.1mg/kg)实验组共4组,每组6只。应用70%FeCl3溶液化学损伤的方法来制备家兔颈动脉血栓模型,采用血栓弹力仪(TEG)描计血栓弹力图,比浊法测定家兔血小板聚集率,ELISA测定各组血浆中α颗粒膜蛋白(GMP-140)和血栓素B2(TXB2)水平,光镜和透射电镜分别观察动脉血栓形成和血小板形态的改变。结果:AHV-PI实验组与模型组相比,血栓弹力图凝血时间(R)值和血凝块形成时间(K)值延长(P<0.01和P<0.05),Alpha角度、最大幅度(MA)和凝血指数(CI)减小(P<0.05和P<0.01);血小板聚集率的各项指标均明显降低(P<0.05);血浆中GMP-140和TXB2含量降低(P<0.01)。AHV-PI实验组光镜下动脉内未见血栓形成,血小板电镜显示血小板形态基本规则,与模型组相比伪足较少,α-颗粒和致密颗粒无明显减少,胞浆空泡化现象减轻。结论:AHV-PI可以通过抑制血小板聚集,防止动脉血栓的形成,其机制可能与之保护血小板超微结构,减少血小板脂质代谢和颗粒内容物的释放有关。

中华眼镜蛇毒活性组分体外抑制三维血管生成的实验研究

目的研究中华眼镜蛇毒活性组分的抗血管生成作用。方法采用拟血管生成三维培养法,观察活性组分对体外血管生成的抑制效应。结果活性组分可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管网状三维结构的反应,0.6、1.2、2.4μg·ml-1的不同浓度组分抑制程度不同。在0.6μg·ml-1浓度组,培养基质Matrigel中的内皮细胞团只形成局部的、不完整的空间网状结构;在1.2μg·ml-1浓度组,悬浮于凝胶中的细胞团所形成的管芽不能相互连接而形成空间网状结构;在2.4μg·ml-1浓度组,细胞散在悬浮于胶层中大部分不能粘聚,且随培养时间的延长无明显的结构变化。结论中华眼镜蛇毒活性组分具有体外抑制血管生成的生物活性。

蛇毒毒素抗血栓作用的研究与应用概况

蛇毒是毒蛇的毒腺分泌物,无毒蛇没有毒腺,亦无毒液分泌。毒腺分泌的毒液,经过毒腺导管沿毒牙沟道流出,故当毒蛇咬伤人体时,毒液可流至受伤组织,毒害人体。蛇毒是一复杂的混合物,含有蛋白质、肽类、核苷、金属离子等。包括多种活性组分,胎甲蛋白酶、磷酸二酯酶、磷脂酶A、神经毒素、细胞毒素、血液血管毒素与肌肉毒素等。本文仅就蛇毒毒素的抗血栓作用作一概述。

不同剂量蛇毒抗高凝状态酶对小鼠肝癌H2 2生长作用的实验研究(英文)

目的 :探讨不同剂量蛇毒抗高凝状态酶 (AHCSE)对小鼠肝癌H2 2生长作用的影响。方法 :小鼠皮下接种小鼠肝癌(H2 2 )后 ,待肿瘤长成 1 0mm2 分别经腹腔注射不同剂量AHCSE,每天 1次 ,连续 1 0d ,观察瘤重抑制率、瘤体积、抑瘤率、脾指数和白细胞及其组成成分 ,统计采用LDS t,检验水准α =0 .0 5。采用白细胞及其组分与脾指数的相关和回归。结果 :中、高剂量组AHCSE具有明显的抗肿瘤作用 ,而低剂量组抗肿瘤作用效果不佳 ,但高剂量组的小鼠体重降低明显。实验组的脾系数明显高于对照组 ,并且随着AHCSE的剂量增大脾系数也增大。白细胞随着AHCSE剂量的增大而增大 ,白细胞及其组分与脾指数存在相关性和回归直线。结论 :在一定的范围内 ,随着AHCSE的剂量增大 ,抗肿瘤效果增强 ,但副作用也增大 。

广西尖吻蝮蛇毒小分子多肽组分对A2780细胞抑制作用的研究

目的探讨广西尖吻蝮蛇毒小分子多肽组分(K组分)对人卵巢癌细胞株A2780的增殖抑制作用以及作用机制。方法采用MTT法检测K组分对癌细胞株的生长抑制情况;黏附实验观察K组分抗细胞黏附作用;采用AO-EB双荧光染色和流式细胞术检测凋亡的发生。结果 K组分对人卵巢癌细胞株A2780的增殖有抑制作用并呈明显的时-效及量-效关系,能够对抗细胞和FN的黏附。AO-EB双荧光染色和流式细胞术都检测到细胞凋亡。结论 K组分对体外培养的人卵巢癌细胞株A2780的增殖有显著的抑制作用,作用机制可能与抗细胞黏附,诱导细胞凋亡有关。

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的抗凝作用及其机理研究

目的:研究短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的抗凝作用及机理。方法:用薄层层析方法确定抗凝蛋白与磷脂酰胆碱结合。按试剂盒说明进行活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(FIB)含量以及对凝血因子的测定。结果:短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白具有精氨酸酯酶活性,能明显地延长活化部分凝血活酶时间(APTT)和稀释的蝰蛇毒时间(DRVVT),减少组织凝血活酶抑制试验(TTI)试剂的磷酯浓度,能加速其抗凝作用,其抗凝活性与磷脂结合及干扰Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子活性有关。结论:短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白能够抗凝、抑制Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子活性并与磷脂结合。

江浙蝮蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的研究 Ⅰ.分离纯化和初步表征

江浙蝮蛇毒中存在有多种精氨酸酯酶,其中有多种已被纯化,本研究应用离子交换和凝胶过滤等方法,新分离纯化了一种精氨酸酯酶,命名为Agkihpin,分子量约为25·46KDa,等电点约为7·43,含235个氨基酸残基,糖蛋白染色阴性,是单链蛋白,对TAME的最适pH为8·2。

中华眼镜蛇毒神经生长因子的研究

采用ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ和ＳｅｐｈｏｓｉｌＣ８以及ＨＰＬＣ层析方法，自广西产中华眼镜蛇毒中分离纯化神经生长因子（ＮＧＦ），此ＮＧＦ经８ｄ鸡胚背根神经节体外培养证明具有促进神经纤维生长的活性。经ＨＰＬＣ及聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一组成，经ＳＤＳＰＡＧＥ及ＨＰＬＣ测定分子量分别为２４．１ＫＤ和２４．９ＫＤ，等电聚焦电泳测得ｐＩ为８．２，氨基酸组分分析表明ＮＧＦ含酸性氨基酸较少，通过１２５｜标记ＮＧＦ测定出ＮＧＦ在生物体内主要分布于肾、肺。

蛇毒抗高凝状态酶抑制小鼠肝癌H22生长作用的实验研究

目的 探讨蛇毒抗高凝状态酶 (AHCSE)对实验性BALB/C小鼠抗肿瘤 (H2 2肝癌 )的作用。方法 小鼠皮下接种小鼠肝癌H2 2后 ,待肿瘤长成 10mm3 左右分别经腹腔注射AHCSE、5 Fu和肝素 ,每天 1次 ,连续 10天 ,观察瘤重、瘤重抑制率、瘤体积、瘤体积抑瘤率和脾指数。结果 AHCSE有显著的抗肿瘤作用 (P <0 .0 1) ,抗肿瘤效果与 5 Fu接近 ,但副作用较小 ,而肝素效果不佳 ;AHCSE组的脾系数有显著增高。结论 AHCSE有显著抗肿瘤作用 。

尖吻蝮蛇毒活性肽K组分的研究

目的从尖吻蝮蛇毒中分离纯化一种小分子活性肽K组分,测定其理化性质及生物学活性。方法经Sephadex G-75凝胶过滤,超滤,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离纯化活性肽K,采用高效液相鉴定纯度,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量,等电聚焦法测定等电点,用比浊法测定其抗血小板聚集活性,通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测K组分对血管生成的影响。结果从尖吻蝮蛇毒中分离相对分子量约为7 862D,等电点为4.29的组分。该组分能抑制由二磷酸腺苷(ADP)、胶原(collagen)、凝血酶(thrombin)诱导的血小板聚集并成剂量依赖性;具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论从尖吻蝮蛇毒中纯化出活性肽K,该组分有很强的抗血小板聚集和抗血管生成作用。

圆斑蝰蛇泰国亚种(Vipera russe lli siamensis)蛇毒凝血因子激活剂的纯化及部分特性研究

目的 从圆斑蝰蛇泰国亚种蛇毒中分离纯化凝血 因子 (F )激活剂并研究其部分特性。 方法 采用离子交换柱层析和凝胶过滤等方法进行分离纯化 ,以血液凝固时间及发色底物 (S- 2 2 2 2 )进行活性鉴定和温度、p H值、蛋白酶抑制剂对活性的影响 ,SDS- PAGE进行分子量、等电点及纯度测定 ,苯酚 -硫酸法及间苯二酚 -盐酸法测定糖含量。 结果 所得促凝组分 1 能特异性地活化牛 F ,从而水解 S- 2 2 2 2酰胺键。SDS- PAGE呈现单一蛋白带 ,分子量为 6 1.1± 1.5 k D(还原 ) ,6 0 .4± 1.9k D(非还原 )。等电点为 p H=8.0 0± 0 .0 6。含中性己糖 12 .4 %±0 .5 % ,唾液酸 0 .12 %± 0 .0 2 %。在 5 0℃以下稳定 ,最适 p H为 7.0～ 8.2。可被金属蛋白酶抑制剂 EDTA- Na2 完全抑制 ,二硫苏糖醇 (DTT)及 L -半胱氨酸部分抑制 ,不受胰蛋白酶抑制剂抑肽酶抑制。 结论 从圆斑蝰蛇泰国亚种蛇毒分离纯化的 F 激活剂是一种碱性糖蛋白 ,属于 Ca2 + 依赖性的金属蛋白酶。

广西尖吻蝮蛇毒K组分抗血管生成活性研究

目的探讨广西尖吻蝮蛇毒小分子多肽组分(K组分)对血管生成的抑制作用。方法采用噻唑蓝法检测K组分对培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304的生长抑制情况,结晶紫法测定K组分对ECV304细胞的黏附抑制作用,鸡胚尿囊实验观察K组分对血管生成的影响。结果 K组分对人脐静脉内皮细胞株ECV304的增殖有抑制作用并呈明显的时-效及量-效关系,能够抑制ECV304细胞与纤维连接蛋白的黏附和鸡胚尿囊血管生成。结论广西尖吻蝮蛇毒K组分对血管生成有抑制作用。

中华眼镜蛇毒组分F的体外抗血管生成活性研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分F对血管内皮细胞黏附功能的抑制作用和体外的抗血管生成活性。方法MTT快速测定法测定组分F对原代培养的血管内皮细胞对纤维蛋白原(Fg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响;采用平面拟毛细血管生成培养法,观察组分F对血管生成的抑制效应。结果组分F可抑制血管内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fg和Matrigel 3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性,组分F对细胞黏附Fg和Matrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05);组分F可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管样网状结构的反应,并且随浓度的不同抑制程度有明显不同。结论中华眼镜蛇毒组分F具有体外抗血管生成活性。

中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大鼠体内分布的研究

中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子经125I标记后从大鼠舌静脉注入，2h后观察其在体内的分布。结果显示：主要分布在肾、肺、肝等脏器及周围神经，脑、喷球及脊髓的含量几乎为零。肾组织含量最高，占72％，说明代谢物主要经肾组织从尿中排除。