分离分析技术在蛋白质组学研究中应用的新进展

蛋白质组学研究的核心技术之一是分离分析方法。该综述重点评述了分离分析技术在蛋白质组学研究,即在蛋白质组表达谱构建、翻译后修饰蛋白质组研究、蛋白质复合体和相互作用研究、蛋白质组定量研究中应用的新进展,介绍了各种分离分析方法的优点、应用范围和有待解决的问题。引用文献89篇。

蛋白质组技术在中药配伍药理学和毒理学机制研究中的应用

配伍用药是中药遣药组方、辨证施治的主要形式和应用特点。组方的宜忌多来自前人经验的总结,大多缺少相应的分子机制研究做配伍的理论支撑。作为规模化研究蛋白质的工具,蛋白质组技术可以从整体水平,较全面地呈现中药多种有效成分进入机体后发挥的多途径、多靶点调控过程,进而揭示中药配伍发挥宜忌作用的分子机制。本文对近年蛋白质组技术,包括双向电泳、荧光双向差异凝胶电泳技术和基于稳定同位素标记的相对和绝对定量技术在中药配伍宜忌和相应的药理毒理学机制研究中的应用进行综述,为进一步探讨中药配伍宜忌原理,更好地实现中药现代化和实际临床用药发展提供理论指导基础。

质谱智能选择反应监测用于蛋白质绝对定量中母子离子对确证的方法研究

质谱选择反应监测(SRM)技术在蛋白质绝对定量分析中的应用越来越广泛,其成功应用的关键是肽段母子离子对的正确选择与确证。触发采集二级图谱是目前常用的母子离子对确认方法,但分析效率有待于提高。质谱智能选择反应监测(iSRM)是新近发展的高通量分析方法。为了考察该方法用于通量化母子离子对确证时的效果,选用牛血清白蛋白(BSA)和酵母蛋白提取物作为样品进行分析。结果表明,该方法具有更高的分析灵敏度,可以对低至1 fmol BSA样品中的母子离子对进行确证,而且相对于触发采集二级图谱方法而言,具有更高的分析通量,为规模化母子离子对选择与确证提供了一种新的策略。

高效硅胶化学键合固定相的研究进展

对高效液相色谱用硅胶作为基质的化学键合固定相的研究进展进行了全面的评述。介绍了硅胶基质填料的物理化学性质及前处理过程,详细阐述了化学键合固定相的键合反应机制和种类,概括了化学键合固定相在高效液相色谱中的应用,并对我国的硅胶基质填料研究和应用前景进行了展望。

人类蛋白质组计划研究现状与趋势

在人类基因组草图完成之际,一批科学家迅速集结于国际人类蛋白质组组织(HUPO)旗下,启动"人类蛋白质组计划(HPP)"。近20年来,以鉴定和定量复杂体系中基因组编码全套蛋白质为核心的蛋白质组学技术获得了空前发展。在这篇文章中,我们将回顾HPP的发展历程和我国在蛋白质组学领域的最新进展,并简略讨论"蛋白质组学驱动的精准医学"的发展趋势和应用前景。

带喷头混合型毛细管色谱柱的制备及其在蛋白质组分离分析中的应用

本研究制备了一种应用于液-质联用(LC-MS)系统中的带喷头混合型毛细管色谱柱.用标准蛋白和酵母蛋白胰蛋白酶酶切溶液考察了其在LC-MS中的离子化效率、毛细管色谱柱分离性能和寿命,并与直接填充型毛细管色谱柱的色谱性能进行比较,未见显著性差异.将制备的带喷头混合型毛细管色谱柱应用于鼠肝蛋白组的分析,在假阳性率为1%的条件下鉴定到1262个肽段,归属于513个蛋白簇.通过对鉴定蛋白质理化性能的统计分析,其等电点和分子量分布高于一般两维凝胶电泳的范围.实验结果还表明该混合型毛细管色谱柱在肽段的理化性能上没有偏性,可以广泛应用于蛋白质组学的研究中.

基于质谱技术的蛋白质组定量方法

对不同状态下的蛋白质在表达和修饰水平上进行精确定量,对于探索蛋白质的生物功能、发现疾病的生物标志物都具有重要意义,也是当前蛋白质组学的一个重要研究前沿。近年来,各种蛋白质组定量的新技术和新方法不断涌现,但仍面临着巨大挑战。本文就基于质谱技术的多种蛋白质组定量方法的基本原理、近几年的研究进展和应用进行评述。

反相高效液相色谱双梯度洗脱分离肽混合物及质谱分析

复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。"鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一。本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析。将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905。该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景。

强阳离子交换色谱分离多肽混合物的条件优化

以酵母全蛋白提取液的胰蛋白酶切产物为研究对象,对多维色谱分离中常用的强阳离子交换色谱的分离条件,包括上样量、盐的种类、调节缓冲液pH值的酸的种类及有机溶剂的比例进行了考察和比较。结果表明,在强阳离子交换色谱分离线性上样量范围内,在氯化铵溶液作为流动相,用磷酸调节流动相缓冲液pH值至2.7,且流动相中乙腈的体积分数为30%条件下进行梯度洗脱时,可获得最佳的分离结果。本结果可为采用二维色谱-质谱策略分析多肽混合物时的第一维强阳离子交换色谱分离条件的选择提供有益的参考。

基于抗原表位制备抗人GP73单克隆抗体

目的：制备抗GP73蛋白的单克隆抗体（mAb）。方法：将GW／3蛋白N末端的肽段（AAAERGAVELK）展示于T7噬菌体表面，扩增重组噬菌体作为抗原免疫小鼠，制备抗体。通过ELISA法检测小鼠血清抗体的效价，筛选分泌抗GP73蛋白抗体的杂交瘤细胞株；通过ELISA、Western blot等方法检测mAb的特异性。结果：利用表面展示GP73抗原表位的重组噬菌体为抗原免疫小鼠，通过细胞融合和筛选得到了能识别GP73蛋白的mAb，且特异性较好。结论：将蛋白质抗原的合适抗原表位展示在T7噬菌体表面，用这种重组噬菌体作为替代抗原可以制备识别全蛋白的mAb。