高密度脂蛋白在抗感染中的作用

高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的基本功能是参与脂类运输。有大量证据表明HDL在抗感染中起重要作用。HDL能中和革兰氏阴性菌脂多糖及革兰氏阳性菌脂磷壁酸,并具有广谱的中度抗病毒作用。HDL的1个亚类,锥虫裂解因子,能防御许多种非洲锥虫感染以及利什曼原虫感染。

重组A群链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶与脂蛋白(a)的相互作用

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性。因此本实验室提出了Lp(a)可能与GAS表面的Plg受体相结合,进而可能竞争性抑制GAS与Plg结合的假说。本研究克隆了GAS的GAPDH及其C末端敲除赖氨酸残基的突变体基因,酶切后将其连接到表达载体pASK-IBA37中,并在大肠杆菌BL-21中表达了这两个重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对rGAPDH和rGAPDHΔ345与Lp(a)的相互作用机制进行了研究。结果表明rGAPDHΔ345与Lp(a)的结合值比rGAPDH显著降低,说明rGAPDH及rGAPDHΔ345与Lp(a)通过LBS发生特异性结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)可以抑制这种结合,Lp(a)对rGAPDH与Plg的相互作用也有明显的抑制。

链球菌表面三磷酸甘油醛脱氢酶及其突变体重组蛋白的表达和纯化

表达并纯化M6型GAS表面三磷酸甘油醛脱氢酶以及其敲除C末端赖氨酸残基重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。克隆了M6型GAS ATCC32175的GAPDH基因以及GAPDHΔ345基因,与pASK-IBA37载体连接后,表达蛋白并用亲和层析色谱纯化重组蛋白;对重组蛋白进行质谱检测,并用酶切方法进一步纯化目的蛋白,通过酶促反应实验测定了重组蛋白的生物活性。2种基因克隆条件稳定,蛋白表达量大,酶切后纯度高,纯化的重组蛋白具有较高的生物活性。功表达并纯化了rGAPDH和rGAPDHΔ345蛋白。

链球菌表面烯醇化酶重组蛋白多克隆抗体的制备

制备M6型GAS表面烯醇化酶抗体。皮下多点注射GAS表面烯醇化酶重组蛋白(rSEN)免疫家兔,采用亲和层析纯化免疫血清,通过SDS-PAGE、ELISA、Western-Blot等方法检测抗体的特异性,并初步用制备的抗体检测了M6血清型GAS表面烯醇化酶的表达。制备的抗体蛋白纯度较高,检测的特异性较强,用制备的抗体可以检测到活体菌表面的烯醇化酶。成功制备并纯化得到了GAS表面烯醇化酶多克隆抗体。

M6型A群链球菌表面烯醇化酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶特性的研究

表面烯醇化酶(surface enolase,SEN)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(surface glyceraldehydes-3-phosphate dehydro-genase,sGAPDH)都是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)没有跨膜结构的膜表面蛋白,它们可能在GAS感染中起到重要的作用。在本研究中,对SEN和sGAPDH在M6型GAS不同生长阶段(即在对数期和稳定期)的表达情况进行检测分析。取对数期(OD600=0.5-0.6)和稳定期(OD600=1.5-1.6)的GAS,分别测定SEN和sGAPDH活性。同时用变溶菌素(mutanolysin)提取这2个生长阶段细胞壁结合蛋白,用Western blot检测该提取物中的SEN和sGAPDH。结果表明在相同菌细胞浊度的条件下,SEN在M6型GAS对数期时的表达量及活性比其稳定期时的高45%左右。虽然sGAPDH的表达量较高但活性很低(<0.07mM NADH/min),并且在这2个生长阶段没有明显的差异。

调理素的研究进展

简述了补体、抗体、C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白、甘露糖凝集素、表面活性蛋白、纤粘蛋白等七类调理素的研究,报道了新发现的调理素低密度脂蛋白和高密度脂蛋白,并对抗感染免疫学研究的新视角进行了展望。

重组不可分型流感嗜血杆菌E蛋白与血浆脂蛋白(a)的相互作用

目的:E蛋白(Protein E,PE)是不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenza,NTHi)表面的一种纤溶酶原(plasminogen,Plg)受体,其C末端含有两个赖氨酸残基。NTHi可通过其表面的PE与Plg结合,从而利用机体的纤溶系统深层入侵宿主。基于脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]中载脂蛋白(a)[Apolipoprotein(a),Apo(a)]与Plg高度的同源性,拟证明Lp(a)是否会与重组表达的PE(r PE)结合。方法:原核表达并纯化r PE及敲除C末端两个赖氨酸残基的r PEΔKK,密度梯度离心结合阴离子交换层析分离人血浆Lp(a),通过ELISA、Pull down、Western blot等方法研究r PE与Lp(a)的相互作用。结果:r PE与Lp(a)结合,但不与LDL结合,且r PEΔKK与Lp(a)的结合能力明显低于r PE;赖氨酸类似物6-氨基乙酸(EACA)能有效抑制r PE与Lp(a)的结合;Lp(a)对r PE与Plg的结合具有微弱的抑制作用。结论:r PE能够与Lp(a)结合,其中r PE的C末端赖氨酸残基和Apo(a)的赖氨酸结合位点(lysine binding sites,LBS)是r PE与Lp(a)结合的主要位点。

铜绿假单胞菌表面(氧化)低密度脂蛋白配体的研究

【背景】研究发现铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与(氧化)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL/oxidized low density lipoprotein,ox LDL)具有特异性相互作用,有报道证实P. aeruginosa表达的Rah U蛋白可以与LDL/ox LDL特异性结合。【目的】验证Rah U蛋白是否是P.aeruginosa表面主要的LDL/ox LDL配体。【方法】大肠杆菌表达Rah U蛋白(r Rah U),ELISA验证r Rah U与LDL/ox LDL的相互作用。利用同源重组的方法构建RahU基因缺失突变株(ΔRahU菌株)作为阴性对照菌株,制备小鼠抗r Rah U抗体,经WesternBlot及ELISA分别检测抗r Rah U抗体与P.aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白的结合。通过ELISA方法对P. aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/ox LDL的结合差异进行比较,并对不同蛋白酶水解ΔRahU菌体表面蛋白后ΔRahU菌株与LDL/ox LDL结合能力的差异进行比较。【结果】经ELISA验证rRahU与LDL/oxLDL存在特异性结合。Western Blot及ELISA方法证实小鼠抗rRahU抗体可以与P. aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白特异性结合,而不与ΔRahU菌株相互作用。P.aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/oxLDL结合能力无显著差异,且蛋白酶水解后ΔRahU菌株与LDL/oxLDL的结合能力相近。【结论】RahU蛋白是P. aeruginosa表面的LDL/oxLDL配体之一,但不是唯一的配体。

铜绿假单胞菌二氢硫辛酸酰胺脱氢酶的重组表达及其与脂蛋白(a)的相互作用

【目的】二氢硫辛酸酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,Lpd)是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)表面的一种纤溶酶原(Plasminogen,Plg)受体,旨在研究Lpd与脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]以及Plg之间的相互作用。【方法】用大肠杆菌表达rLpd及其突变分子(rLpd K476A、rLpd K477A、rLpdΔKKR),用酶联免疫吸附实验(ELISA)、亲和色谱层析及Western blot等技术检测rLpd及其突变分子与Lp(a)、Plg的相互作用。【结果】ELISA及亲和色谱层析实验结果表明,rLpd可以与Lp(a)结合但不与LDL结合,Lp(a)与rLpdΔKKR的结合能力显著低于其与rLpd的结合能力。1 mmol/L的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)对rLpd与Lp(a)的结合有显著的抑制作用。1 000μg/L的Lp(a)对rLpd与Plg的结合起到显著的抑制作用。【结论】Lpd能够与Lp(a)特异性结合,其476和477两个相邻的赖氨酸残基是与Lp(a)结合的主要位点,Lp(a)可以竞争性地抑制rLpd与Plg的结合。

细胞因子诱导杀伤细胞治疗肿瘤的临床免疫学评价体系

细胞治疗作为抗肿瘤的新型模式已在临床广泛开展。细胞因子诱导杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞具有较强增殖、杀伤和提高机体免疫反应的作用,其治疗技术成为细胞治疗领域的先导。

重组金黄色葡萄球菌次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶与脂蛋白(a)的相互作用

次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,它可以通过赖氨酸结合位点(LBS)与Plg相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性,即两者的Kringle结构域都含有LBS,其中Apo(a)的KIV10含有强的LBS。因此本实验提出了Lp(a)应该能够与S.aureus表面的Plg受体相结合,进而可能竞争性抑制S.aureus与Plg结合的假说。本研究克隆了S.aureus的IMPDH基因,酶切后将其连接到表达载体pASK-IBA37中,并在大肠杆菌BL21中表达了该重组蛋白(rIMPDH)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、亲和色谱层析及Western blot对rIMPDH与Lp(a)的相互作用机制进行了研究。结果表明rIMPDH可以通过LBS与Lp(a)和rKIV10发生特异性结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)可以抑制这种结合,然而本研究并未发现Lp(a)和rKIV10对rIMPDH与Plg的相互作用有明显的抑制。

M41型A群链球菌的Ⅰ型胶原样蛋白与人低密度脂蛋白的相互作用

【目的】检测M41型A群链球菌(GAS)ATCC12373中Ⅰ型胶原样蛋白(Scl1)与人低密度脂蛋白(LDL)的相互作用。【方法】克隆了M41型GAS ATCC12373的Ⅰ型胶原样蛋白(Scl1)及其V区(Scl1-V)基因,并表达、纯化重组蛋白rScl1(C176)和rScl1-V(C176V)。通过重组蛋白与人血浆的亲和色谱层析、Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测C176、C176V与LDL的相互作用;通过GAS与LDL的ELISA试验和人血浆与GAS的共孵育试验,检测GAS与LDL的相互作用。【结果】结果证明C176和C176V可以与LDL特异性结合;表达Scl1的M41型GAS可以与LDL相结合。【结论】M41型GAS的Scl1可以与LDL特异性结合。

人脂蛋白(a)与金黄色葡萄球菌重组α-烯醇化酶的相互作用

表面α-烯醇化酶(Eno)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)重要纤溶酶原受体(Plr),其C端Lys残基是与纤溶酶原(Plg)Kringle结构域(K或K结构域)结合位点之一。人脂蛋白(a)(Lp(a))是由一分子载脂蛋白(a)(apo(a))和一分子低密度脂蛋白(LDL)通过二硫键结合构成,apo(a)上的K结构域与Plg的K结构域具有高度同源性,都有赖氨酸结合位点(LBS)。Apo(a)的KIV_(10)是主要的LBS。因此假设,Lp(a)也可能与Eno结合,从而竞争性抑制Eno与Plg的结合。本文为研究Lp(a)与Eno的相互作用机制,在大肠杆菌中重组表达了Eno(rEno)及敲除C末端Lys残基(第434个氨基酸残基)的Eno(rEno△434)和apo(a)的KIV_(10)结构域(rKIV_(10));用酶联免疫吸附试验(ELISA)和亲和色谱层析(Pull down)对rEno、rEno△434与Plg、Lp(a)、LDL、rKIV_(10)的相互作用机制进行了研究。结果表明,rEno与Plg、Lp(a)、rKIV_(10)呈特异性结合,一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)能够抑制它们的结合,证明Lp(a)与rEno也是通过LBS结合;rEno不与LDL结合,证明Lp(a)是通过apo(a)与rEno结合;rEno△434与Plg和Lp(a)的结合有明显降低,证明rEno的C端Lys残基是与Lp(a)结合的位点之一。

流感嗜血杆菌表面天冬氨酸酶和其突变体蛋白的表达纯化及酶活性测定

目的表达纯化不可分型流感嗜血杆菌表面天冬氨酸酶(r ASP)和其敲除羧基末端赖氨酸的重组蛋白(r ASPΔK)。方法克隆了不可分型流感嗜血杆菌ATCC49247的ASP基因和ASPΔK基因,与载体连接后,转入大肠杆菌表达蛋白,并用Co2+亲和柱层析纯化蛋白;采用酶促反应测定纯化蛋白的酶活性。结果两种基因的克隆和表达质粒构建成功,目的蛋白表达量大且具有较高的酶活性。结论成功表达纯化了r ASP和r ASPΔK蛋白。

A群链球菌利用人纤溶酶原的机制

A群链球菌是一种常见的人类致病菌,可以引起人类的化脓性感染和非化脓性后遗症。A群链球菌能表达或分泌多种毒力因子参与其致病性。大量文献报道,纤溶酶原也是A群链球菌侵入机体的重要因子,A群链球菌通过其纤溶酶原受体能与纤溶酶原特异性结合,从而使与A群链球菌结合的纤溶酶原更易被激活为纤溶酶。纤溶酶能降解宿主的细胞外基质和基底膜,有利于A群链球菌在人体内的扩散。本文就A群链球菌如何激活并利用人纤溶酶原的机制进行了综述。

纤溶酶原在金黄色葡萄球菌感染中的作用

金黄色葡萄球菌菌体表面有多种纤溶酶原受体,包括次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶、核糖核苷酸还原酶、α-烯醇化酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶等,它们均可以与纤溶酶原结合。与细菌结合的纤溶酶原可被宿主的纤溶酶原激活剂(组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂)或葡萄菌属的纤溶酶原激活剂(葡激酶)激活为纤溶酶。细菌表面的纤溶酶有利于其降解宿主胞外基质,穿越组织屏障,因此哺乳动物的纤溶酶原可能在金黄色葡萄球菌感染宿主过程中起重要作用。