浅谈如何做好新时代基础医学研究

2020年9月11日,习近平总书记在科学家座谈会上勉励科研人员坚持四个面向——面向世界科技前沿、面向经济主战场、面向国家重大需求、面向人民生命健康。二十大报告中也强调基础研究在创新驱动发展战略中的源头作用。面向人民生命健康,是建设健康中国题中应有之义;如何做好新时代基础医学研究,则是广大基础医学研究者面临的时代之问。为了激发大家对这一问题的思考,我将以课题组近些年的研究工作为引子,谈一些粗浅看法,抛砖引玉,供大家交流讨论。

甲基化抑制剂5-杂氮胞苷对T淋巴细胞株程序性死亡受体-1基因启动子区域甲基化水平及其表达的影响

目的:以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azacytidine,5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(programmed death receptor 1,PD-1)基因启动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的关系。方法:以不同浓度的5-Zac分组(0μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组)作用于体外培养的Molt-4细胞72 h,流式细胞仪(flow cy-tometry,FCM)检测细胞表面表达PD-1的Molt-4细胞比例和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(reverse tran-scription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测5-Zac作用后PD-1基因mRNA的转录水平;亚硫酸氢钠处理各组Molt-4细胞DNA,PCR扩增PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态。结果:0μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组的5-Zac作用于Molt-4细胞72 h后,PD-1在细胞表面的表达率分别为(1.13±0.01)%,(18.96±1.87)%和(63.09±6.25)%,并呈现浓度依赖性;PD-1基因mRNA表达量显著增加;细胞凋亡检测结果显示:与0μmol/L组相比,5μmol/L组、10μmol/L组5-Zac处理72 h后Molt-4细胞的凋亡率显著增加,0μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组凋亡率分别为(1.9±0.06)%,(8.98±1.36)%和(24.5±3.68)%,差异有统计学意义(P<0.01);上述3组DNA亚硫酸氢钠测序结果表明:加入甲基化抑制剂5-Zac处理后,PD-1启动子上-601 bp和-553 bp CpG点去甲基化程度明显增高。结论:甲基化抑制剂5-Zac可导致体外培养的T淋巴细胞系Molt-4细胞表面PD-1 mRNA表达显著增加,细胞凋亡率增高,这种增高可能与PD-1基因启动子区域出现的去甲基化有关。

SLE患者T淋巴细胞IL-13受体α1基因表达及其调节序列甲基化状态的研究

目的研究SLE患者外周血T淋巴细胞IL-13受体α1（IL-13Rα1）基因mRNA的表达及IL-13Rα1基因调节序列甲基化状态。方法免疫磁珠法（MACS）分离10例SLE患者和6例正常人外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞，采用实时荧光定量PCR检测T细胞中IL-13Rα1 mRNA的表达，并用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测IL-13Rα1基因调节序列的甲基化水平。结果活动期SLE患者CD4^＋T细胞中IL-13Rα1 mRNA表达水平为2．224±0．251，非活动期SLE患者为1．712±0．132，正常人组为1．104±0．044，三组间比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；CD8^＋T细胞中IL-13Rα1 mRNA表达水平活动期、非活动期及正常人组分别为1．672±0．142，1．410±0．154，1．238±0．106，活动期组与正常人组比较差异有统计学意义（P〈0．05），而非活动期组与正常人组、活动期组与非活动期组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。CD4^＋T细胞中IL-13Rα1基因甲基化指数活动期SLE患者为0．454±0．023，非活动期为0．635±0．065，正常人为0．844±0．097，三组间比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；CD8^＋T细胞中IL-13Rα1基因甲基化指数三组间比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。SLE患者外周血CD4^＋，CD8^＋T细胞IL-13Rα1 mRNA的表达与疾病活动度（SLEDAI评分）呈正相关（r=0．79，P〈0．01；r=0．76，P〈0．05）；CD4^＋T细胞的IL-13Rα1基因的甲基化水平与疾病活动度（SLEDAI评分）呈负相关（r=-0．89，P〈0．01）；CD4^＋T细胞IL-13Rα1 mRNA表达与其调节序列的甲基化水平呈负相关（r=-0．84，P〈0．01）。结论SLE的发生发展可能与DNA低甲基化导致SLE患者T细胞过度表达IL-13Rα1有关。

SLE患者T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲某化状态的探索

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA甲基化状态及其在发病机制中的作用。方法分离9例活动期SLE患者和7例正常人对照外周血CD4^+与CD8^+T细胞,并分别提取DNA。采用亚硫酸氢钠-测序法对CD4^+与CD8^+T细胞穿孔素基因启动子区域DNA甲基化水平进行检测。结果在穿孔素基因启动子区域,正常对照组CD4^+T细胞平均甲基化水平显著高于CD8^+T细胞(P<0.05)。活动期SLE患者CD4^+T细胞平均甲基化水平显著低于正常对照组(P<0.05),而CD8^+T细胞与正常对照组的差异则无统计学意义(P>0.05)。结论活动期SLE患者的CD4^+T淋巴细胞的穿孔素基因启动子区域处于低甲基化状态。

5-杂氮胞苷诱导人淋巴细胞系Molt4细胞PD-1基因启动子去甲基化及PD-1蛋白表达的影响

目的 以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷（5-Zac）对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1（PD-1）基因肩动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的关系.方法 以不同浓度的5-Zac（0、5、10μmoL/L）作用于体外培养的Molt-4细胞72 h,流式细胞术（FCM）检测细胞表面表达PD-1的Molt-4细胞比例和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测5-Zac作用后PD-1基因mRNA的转录水平;亚硫酸氧钠处理各组Molt-4细胞DNA,PCR扩增与转录因子Brn-2结合的PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态.结果 0、5、10μmol/L的5-Zac作用于Molt-4细胞72 h后,PD-1在细胞表面的表达率分别为1.13%4±0.01%、18.96%±1.87%、63.09%±6.25%,并呈现浓度依赖性（P〈0.05）;PD-1基因mRNA表达量显著增加;细胞凋亡检测结果显示与未处理组相比,5-Zac处理72 h后Molt-4细胞的凋亡率显著增加,3组凋亡率分别为1.9%4±0.06%、8.98%4±1.36%、24.5%4±3.68%,差异有统计学意义（P〈0.01）;3组DNA亚硫酸氢钠测序结果表明,5-Zac处理后,与转录因子Bin-2结合位置的CG点明显受到去基化影响,其去甲基化概率与周围其他CG点去甲基化概率比较差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 甲基化抑制剂5-Zac可导致体外培养的淋巴细胞系Molt-4细胞表面PD-1表达显著增加,PD-1基因mRNA表达增加,细胞凋亡率增高;PD-1基因活化和表达的增加可能与5-Zac降低PD-1基因启动子上与转录因子Bin-2结合位置的CG点甲基化水平,从而促进Brn-2与基因启动子结合,使转录表达增加有关.

PD-1基因启动子区域甲基化水平对慢性乙肝患者外周血单个核细胞上PD-1表达的影响

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMCs）上程序性死TL=受体-1（PD-1）表达和PD-1启动子区域甲基化水平的差异及其影响因素，以及两者之间的关系。方法筛选2009年9月至2011年9月在中南大学湘雅二医院传染科门诊就诊144例CHB患者和18名健康献血员，流式细胞术（FCM）检测PBMCs表面表达PD-1的细胞比例，同时进行肝功能检测；时间分辨荧光免疫分析法检测CHB患者血清HBV标志物水平，荧光定量PCR检测血清HBVDNA载量；亚硫酸氢钠处理PBMCs细胞DNA，PCR扩增PD-1启动子基因片段，转化感受态大肠杆菌，挑克隆测序，检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态。结果与正常对照组（10．8％±4．4％）比较，CHB患者PBMCs上PD-1表达水平明显升高。在CHB患者中，PBMCs上PD-1表达在HBeAg阳性患者（27．1％±18．4％）中显著高于HBeAg阴性患者（19．6％±15．6％），PD-1表达水平与HBV-DNA和AIJT水平无明显相关性。PD-1启动子上多个CpG点（-601、-553、-538、-483、-463、-317bp）甲基化程度与PD-1在单个核细胞上的表达呈负相关。结论PD-1基因启动子区域甲基化水平可能影响CHB患者PBMCs上PD-1表达。