绵羊外周血中游离DNA提取及SRY基因检测

【目的】外周血中游离的DNA主要是指存在于血浆/血清等循环系统里的一些小片段DNA,应用在一些疾病的诊断以及非创伤性产前诊断方面。研究三种方法从绵羊外周血浆/血清中分离提取游离DNA,建立高效的外周血游离DNA提取方法,并对SRY基因进行PCR扩增。【方法】利用加热法、酚氯仿法以及试剂盒法对500μL血浆/血清中游离的DNA进行提取。根据游离DNA片段大小的特点分别设计扩增产物大小为168 bp的检测引物和178 bp的SRY基因引物进行普通PCR检测。【结果】利用加热法、酚氯仿法、试剂盒法都提取到了游离的DNA,PCR后通过琼脂糖凝胶电泳检测到了168 bp的目的片段。同时利用PCR扩增到了178 bp的SRY基因目的片段。【结论】不同的提取方法均可有效提取分离绵羊外周血血清和血浆中游离的DNA片段,能够用于SRY基因的检测。

非探针法高分辨率熔解曲线(HRM)对FecB基因分型方法的研究

为了建立一种基于非探针法高分辨率熔解曲线(HRM)技术对绵羊FecB基因高效分型的方法,试验选用健康、成年绵羊48只,利用HRM和限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)对绵羊多胎主效基因FecB基因进行分型效果研究。结果表明:FecB基因具有3种基因型,分别是野生型(AA)37.50%、杂合型(GA)33.33%、纯合突变型(GG)29.17%;通过对基因测序比对、HRM和PCRRLFP结果的准确率比较,HRM的准确率达到了95.83%(46/48),高于RLFP的分型结果,所需试验时间大大缩短。说明非探针法HRM技术是一种高效率、节省人工的FecB基因分型方法。

不同荧光染料对绵羊FecB基因HRM分型效果影响的实验研究

高分辨率熔解曲线(HRM)是基于新型饱和荧光染料的基因分型技术,本实验旨在研究荧光染料类型、添加量以及添加方式对HRM分型效果的影响。实验分析了3种荧光染料(LC Green、JJ Green、SYBR Green I)、不同荧光染料浓度、染料添加方式对HRM分型差异的比较。结果表明:3个染料中LC Green效果最佳,JJ Green次之,而SYBR Green I不及前两种;染料添加量会对HRM分型产生较大的影响,染料添加量为0.8μL时为最优反应量;而染料添加方式对分析结果没有影响。

绵羊FecB基因非探针法HRM分型技术条件优化研究

本文通过对影响高分辨率熔解曲线(HRM)的因素分析,旨在建立适合绵羊FecB基因分型的最优反应体系。试验分别对扩增子长度、引物量、Mg2+浓度和模板量等因素进行研究。结果表明,不同因素都会对HRM分析结果有影响,绵羊FecB基因非探针法HRM分型的最优反应条件为:引物添加量0.6μL,Mg2+浓度2.4 mmol/L^3.2 mmol/L,模板量50 ng,以及扩增产物为115 bp。