人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达人nm23-H1基因的重组腺病毒载体,并在人胚肾293细胞中进行鉴定。方法:以重组质粒pcDNA3.1-nm23-H 1中提取的nm23-H 1基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pSh uttle-CMV,并转化大肠肝菌DH 5α。筛选重组质粒pSh uttle-CMV-nm23-H 1,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H 1,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长nm23-H 1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-nm23-H 1。大量扩增Ad-nm23-H 1病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测nm23-H1基因在293细胞中的转录。结果:经PCR、酶切鉴定及DNA测序结果证实pSh uttleCMV-nm23-H 1及pAdEasy-nm23-H 1质粒正确构建,纯化后的Ad-nm23-H 1病毒颗粒感染性滴度为109.5(3.4×109)CCID50/ml,经RT-PCR扩增出的基因片段,与目的片段大小一致。结论:已成功构建了表达nm23-H1重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。