结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达

以往在对藤黄微球菌的研究中发现了促进复活因子(RPF),该因子可以有效促进休眠期的多种革兰氏阳性细菌复活和生长。生物信息学分析表明在多种革兰氏阳性细菌的基因组中均存在编码RPF样蛋白的基因。从GeneBank中获得了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、谷氨酸棒杆菌和微链霉菌等革兰氏阳性细菌的多种RPF样蛋白相关信息,通过同源性分析发现这些蛋白均含有一个由75个氨基酸残基构成的高度保守序列,即RPF作用域。进一步对结核分枝杆菌H37Rv株的Rv1009进行了分析,并用PCR法克隆了其编码基因全长,定向克隆至pGEX 4T-2,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了Rv1009-GST融合蛋白的高效表达,为深入探讨其生物学功能奠定了基础。

结核分枝杆菌临床分离株耐药特点分析

目的 :分析临床分离结核分枝杆菌的耐药特点。方法 :用改良罗氏培养基间接药敏实验绝对浓度法检测结核菌的耐药情况。结果 :结核菌总耐药率 83.2 % ,耐多药率为 6 6 .4 %。其中初始耐药率 6 8.4 % ,初始耐多药率 36 .8% ,复治耐药率92 .4 % ,复治耐多药率 84 .7%。结论 :耐药及耐多药结核菌感染是临床治疗结核病的一个严重问题。临床分离结核杆菌耐药率和耐多药率高。分析临床分离株耐药特点 ,对控制结核病传染及指导临床合理用药具有重要意义。

铜绿假单胞菌中Ambler A和D类酶流行状况与药物敏感性研究

目的了解Ambler A和D类β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌(PA)的流行状况及其与药物敏感性的关系。方法用琼脂稀释法检测101株铜绿假单胞菌对8种常用抗菌药物的最低抑菌浓度,并PCR测序法鉴定101株铜绿假单胞菌中Ambler A和D类β-内酰胺酶流行状况。结果101株铜绿假单胞菌对8种常用药物的MIC50的范围为232μg/ml。最有效的药物是美罗培南,但也仅能抑制80·2%的菌株。1种或1种以上β-内酰胺酶基因阳性的有27株,其中tem-1型是最常见的亚型,共有14株菌阳性;有10株菌oxa-10基因阳性;菌株PA36的oxa-Ⅰ群酶基因在基因库中无完全同源序列,将其暂命名为oxa-56like,并已提交基因库,序列号为EF437948。结论铜绿假单胞菌对β-内酰胺类耐药现象非常普遍,产酶株有对广谱抗菌药物广泛耐药的趋势。因此,早期及时地检出产酶菌株对临床治疗中抗菌药物的选择和控制感染的播散都是非常重要的。

无精子症和严重少精子症患者Y染色体微缺失研究

目的:研究Y染色体微缺失与男性不育的关系。方法:采用多重PCR技术,研究正常男性、无精子症和严重少精子症男性不育患者Y染色体无精子因子(AZF)区域3个序列标志位点(STS)的缺失情况。结果:在93例无精子症或严重少精子症患者中,15例有Y染色体微缺失,缺失率为16%。其中,42例无精子症患者中,6例为AZFc区SY255位点缺失,2例为AZFb区SY134位点缺失;51例严重少精子症患者中,7例为AZFc区SY255位点缺失。40例正常男性无Y染色体微缺失。结论:多重PCR技术是简便而有效的对男性不育患者进行Y染色体微缺失筛查的方法;Y染色体微缺失是造成男性不育的一个重要原因,对男性不育患者进行辅助生育技术治疗前应常规进行Y染色体微缺失的检测。

IgG Fab-BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建抗抗LPSFab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A2IgG的Fd和完整轻链LCcDNA片段。在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPIN端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白FB真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGHpolyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3-FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mR-NA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗κ轻链和抗BPI抗体反应的蛋白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论成功地在CHO细胞中表达出了抗LPSFab-BPIFB融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。

COX-2抑制剂联合顺铂对胰腺癌细胞增生和凋亡的影响

目的:探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂Celecoxib和顺铂联合应用对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响. 方法:用Celecoxib和顺铂处理胰腺癌BxPC-3细胞后,用噻唑蓝(MTT)检测细胞的相对存活率,RT-PCR检测COX-2 mRNA的表达,流式细胞术和Hoechst-33 258染色检测其对BxPC-3的凋亡诱导作用. 结果:Celecoxih作用于BxPC-3细胞后,细胞的存活率呈剂量和时间依赖性,其中24 h的IC50值为100 nM, Celecoxib可明显降低BxPC-3细胞COX-2 mRNA的表达; Celecoxib和顺铂联合应用对胰腺癌细胞增生的抑制和凋亡的诱导作用更加明显,Hoechst-33 258染色可呈现凋亡的形态学改变. 结论:COX-2抑制剂和顺铂联合应用对抑制胰腺癌细胞增生和诱导细胞凋亡的高效性,表明其在临床上具有潜在的应用价值.

大鼠心肌成纤维细胞组织金属蛋白酶抑制剂mRNA水平检测(英文)

目的通过建立多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,旨在测定大鼠心肌成纤维细胞组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的mRNA水平。方法采用胶原酶-胰蛋白酶消化法培养成年雌性SD大鼠的心肌成纤维细胞,提取细胞总RNA并进行反转录反应。自行设计大鼠TIMP-1,TIMP-2和内参照GAPDH的PCR引物序列,进行多重PCR反应,PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分析目的基因片段。结果20g/L琼脂糖凝胶电泳在同一条泳道显示TIMP-1,TIMP-2和GAPDH3条目的DNA条带,表明成功地同时扩增了TIMP-1,TIMP-2和GAPDH基因。结论采用多重RT-PCR方法,测定了大鼠心肌成纤维细胞TIMP-1,TIMP-2mRNA水平,此方法为研究高血压病心肌纤维化提供了可靠手段。

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的 :克隆人高迁移率族蛋白 1(HMG 1)编码基因 ,构建重组表达载体并对其诱导表达 .方法 :通过RT PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG 1的编码基因 ,克隆于载体pGEM Teasy,测序分析后亚克隆于表达载体 pGEX 4T 2 ,测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α ,经IPTG诱导 4h后可表达Mr 约 5 6 0 0 0的融合蛋白GST HMG1.结果 :克隆了人HMG 1的编码基因 ,构建了融合蛋白的重组表达质粒 pGEX HMG1,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测 ,占全菌总蛋白的 0 .2 3.结论 :获得了人HMG 1编码基因及其原核表达产物 ,对研究人HMG

survivin短发夹状RNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌细胞survivin表达的影响

目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin表达的抑制作用。方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达。结果:成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好。结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

目的 建立体外培养扩增树突状细胞 (DC)的方法 ,并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用 .方法 分离外周血单个核细胞 ,应用 GM- CSF 及 IL- 4诱导 DC产生 ,用 TNF- α和PGE2 促进其成熟 ,并用肺癌细胞系 GL C- 82可溶性抗原致敏 .将成熟 DC与自体 L AK细胞混合培养 (DC- L AK) ,用MTT法检测 DC- L AK细胞及 L AK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用 .结果 经 GM- CSF,IL - 4,TNF-α,PGE2 作用后 ,细胞表达 CD1 a阳性率为 71.0 % ,CD83 5 0 .0 % ,CD1 4 阳性率低于 10 .0 % ,高表达 HL A- ,HL A- 和 CD45,为典型的 DC表型特征 .DC- L AK和 L AK细胞对 4种肿瘤细胞 (GL C- 82 ,A5 49,m oser和 MCF- 7)的杀伤率 ,前者为 84.7% ,6 6 .9% ,49.3%和 5 6 .0 % ,后者为 43.5 % ,31.3% ,45 .0 %和 32 .4% .结论 成功的诱导出具有典型形态特征及增强 L AK细胞杀伤活性的 DC.

婴幼儿急性上呼吸道感染淋巴细胞亚群的改变

目的研究婴幼儿上呼吸道感染时细胞免疫状况的变化情况。方法采用流式细胞仪检测急性上呼吸道感染患儿及正常对照组外周血Th1和Th2的百分率,CD4+与CD8+细胞百分率,CD4+/CD8+比值及CD19+和CD19+CD23+的表达水平,以探讨婴幼儿急性上呼吸道感染T淋巴细胞亚群的变化及B淋巴细胞的活化状况。结果上呼吸道感染的患儿的外周血Th1,Th2的细胞百分率(13.15±6.23及4.57±3.10)均显著高于对照组(7.14±5.09及2.03±0.95),患儿组CD4+细胞百分率亦较对照组为高(P<0.05);CD8+,CD4+/CD8+比值均与正常对照组之间无统计学差异(P>0.05),CD19+与CD19+CD23+的表达阳性率无明显升高。结论婴幼儿上呼吸道感染时可活化T辅助淋巴细胞亚群,表现为Th1和Th2细胞百分率均增加,Th1和Th2细胞免疫反应增强,而B淋巴细胞状况无明显改变。

TTV核酸模板快速制备方法

目的 寻求建立适合大批量临床标本检测 TT病毒(TTV)核酸快速制备方法 ,直接用于 PCR扩增 .方法 应用蛋白酶 K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法 ,分别制备TTV核酸做 PCR模板 ,用于 TTV的聚合酶链反应的快速检测 .结果 在 30例非甲～非庚型肝炎血清和 5 0例慢性乙型肝炎患者血清 ,应用经典的蛋白酶 K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法 ,分别制备 TTV核酸模板 ,在相同条件下进行PCR扩增 ,结果两种制备方法的符合率为 89% .结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒 ,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据 ,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中 TTV核酸制备方法 ,对 TTV肝炎的快速诊断 。

结核分枝杆菌三种耐药基因的检测方法

建立3种结核分枝杆菌耐药基因的检测方法,探讨耐药基因突变与耐药性的关系。将58株临床分离株均做聚 合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和传统药物敏感试验。结果表明,结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药 水平有密切联系,绝大多数结核分枝杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。

免疫荧光法与p53单链构象多态性分析检测胸水肿瘤细胞的结果分析

目的探讨免疫荧光法与 p5 3单链构象多态性分析检测胸水肿瘤细胞 ,在良、恶性胸水鉴别诊断中的价值 .方法 采用免疫荧光法、血卟啉荧光法、吖啶橙荧光法检测胸水肿瘤细胞 ;p5 3单链构象多态性分析技术检测 p5 3基因突变 .结果 应用免疫荧光法、血卟啉荧光法、吖啶橙荧光法 ,通过对 81例恶性胸水患者胸水肿瘤细胞的检测 ,其阳性检出率分别为 :88.9% ,91.4%和 86 .2 % ;对 183例良性胸水患者胸水肿瘤细胞的检测 ,其阳性检出率分别为 :0 .2 2 % ,0 .39%和 0 .79% .结论 吖啶橙荧光法针对的是肿瘤细胞中的核酸物质 ,在荧光显微镜下极易识别 ,色彩鲜艳并具有恶性肿瘤细胞形态的特征 .血卟啉荧光方法 ,比较稳定 ,形态完整 ,红细胞及白细胞不显示荧光 ,荧光清晰 ,易于鉴别 .免疫荧光法 ,针对的是细胞膜抗原 ,当抗原抗体结合后 ,在细胞膜上形成一种荧光环 ,加上肿瘤细胞的特殊形态 ,即可与正常细胞区别 ,从而对胸水中的肿瘤细胞作出精确的诊断 .用 p5 3单链构象多态性分析 ,检测胸水细胞 p5 3基因突变已成为可能 ,对良、恶性胸水的鉴别诊断具有重要的意义 ,并具有较好的应用前景 .

西安地区一株TT病毒的基因克隆及序列分析

目的对TTV阳性扩增产物进行克隆及测序,以了解西安地区TTV基因型及基因结构的特点。方法采用巢式PCR从转氨酶活性异常增高的患者血清中,得到TTV阳性扩增产物,将其插入pGEM-Teasy载体,进行克隆及序列分析。结果获得1个pGEM-TTV重组载体。序列分析表明,插入片段为196bp。该序列与AF065400株等对应位置的核苷酸同源性分别为:AF065400中国株94.9%、AF351132中国株98.0%和NC-002076日本株99.0%。结论西安地区TTV阳性扩增序列与报道的AF065400株、AF351132株和NC-002076株的序列具有高度的同源性,属同个基因型别。

抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)克隆Fd段和κ链基因 ;构建到噬粒pComb3中 ;并用ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析证明表达的Fab段特异性结合人精浆蛋白。结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞系E4B7中克隆出了重链Fd段和κ链基因 ,经序列测定表明 ,Vκ 属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族 ,VH与鼠免疫球蛋白MUSIGHAEI同源性最高。将该Fd和κ链基因克隆到表达载体pComb3中 ,在大肠杆菌中获得了表达。结论 ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析表明 。

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的 构建串联的 MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶 (h TERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体 .方法 将串联的 MYC反应元件修饰的 h TERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因 Fcy1克隆到穿梭质粒 p DC316上 ,与辅助质粒 p BH-Glox(delta) E1,3Cre共转染 HEK2 93细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在 HEK 2 93细胞中扩增重组病毒 . PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度 .结果 成功获得由6倍和 18倍 MYC反应元件修饰 h TERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体 .结论 MYC反应元件修饰 h TERT核心启动子引导 Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础 .

用亲和层析法纯化人精浆蛋白

【目的】用亲和层析法从增生的前列腺组织中纯化人精浆蛋白(-γseminoprotein,-γsm)。【方法】采用超声波粉碎、NP-40提取与两种免疫亲和层析相结合[抗人精浆蛋白单抗(E4B7mAb)亲和层析和蛋白A亲和层析]的新提纯方案,获得了高纯度-γsm抗原。【结果】所纯化的-γsm蛋白经ELISA双抗夹心法和免疫印迹分析检测证明,用此法从增生的前列腺组织中分离到-γsm抗原,而且纯化的-γsm具有生物活性。【结论】这种方法的建立将为分离-γsm抗原提供一种有效途径,为抗精浆蛋白基因工程抗体的研究提供良好的抗原保证。