山羊ESC培养上清液对PBMC和PBL转化及分泌活性的影响

【目的】探索山羊子宫内膜基质细胞(ESC)培养上清,对山羊外周血单核细胞(PBMC)和外周血淋巴细胞(PBL)的转化与分泌活性的影响。【方法】分离山羊PBMC和PBL,制备原代ESC(ESC0)及永生化传至30代的ESC(ESC30)培养上清,将不同培养上清与PHA组合刺激PBMC与PBL转化,应用MTT法检测ESC0及ESC30培养上清对PBMC和PBL转化的作用,ELISA检测PBMC和PBL分泌IL-2I、L-4的相对含量。【结果】ESC0及ESC30上清可刺激PBMC/PBL转化并分泌IL-2和IL-4,抑制PHA-P诱导的PBMC/PBL增殖及IL-2的分泌,但对PHA-P引起的PBMC/PBL分泌IL-4有促进或协同作用。【结论】ESC能通过旁分泌作用影响PBMC和PBL的转化与分泌活性,优势活化Th2型淋巴细胞,在子宫局部免疫调节中发挥重要作用。

四种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎渗透性和毒性作用的比较

作为胚胎冷冻保存的基础性研究,冷冻保护剂的渗透性和毒性研究非常重要。本试验选用1,2-丙二醇、甘油、乙二醇和二甲基亚砜4种常用冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚胎进行渗透性和毒性研究。结果显示:1.5mol/L的1,2-丙二醇、乙二醇和二甲基亚砜冷冻保护剂对2-细胞胚胎的渗透性显著高于甘油保护剂;4种冷冻保护剂对细胞膜的完整性没有影响;1.5mol/L的乙二醇、1,2-丙二醇和甘油保护剂处理后的2-细胞胚胎的囊胚发育率和孵化率与对照组胚胎比较差异不显著(P>0.05),但显著高于二甲基亚砜处理后的2-细胞囊胚发育率和孵化率(P<0.01)。结果表明:在4种冷冻保护剂中,乙二醇和1,2-丙二醇适合于小鼠2-细胞胚胎冷冻保存。

小鼠子宫内膜细胞对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC转化与分泌活性的影响

【目的】探索小鼠子宫内膜细胞培养上清液对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊外周血单个核细胞(Peripheral Blood Monouclear Cells,PBMC)的转化及分泌活性的影响。【方法】采用噻唑蓝(MTT)比色法和酶联免疫吸附测定法(ELISA),分别研究小鼠子宫内膜上皮细胞(Endometrial Epithelial Cells,EECs)和基质细胞(Endometrial Stro-mal Cells,ESCs)培养上清液,对离体培养的小鼠脾脏淋巴细胞、山羊外周血单个核细胞(Peripheral Blood MonouclearCells,PBMC)的增殖转化及白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)和白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)分泌活性的影响。【结果】小鼠子宫内膜基质细胞和上皮细胞培养上清液,均可无种属差异地刺激小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC的增殖转化,同时抑制植物血球凝素(Plant hemaggluti min PHA-P)诱导的小鼠淋巴细胞和山羊PBMC分泌IL-2的活性,但对PHA-P诱导的IL-4分泌有促进或协同作用。【结论】EECs和ESCs通过影响小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PB-MC的增殖转化与分泌活性,优势活化Th2型淋巴细胞,在子宫局部免疫调节中发挥重要作用。

性腺激素对山羊子宫内膜细胞TNF-α与TGF-β分泌活性的影响

为探讨性腺激素对山羊子宫内膜细胞分泌活性的影响,基于套皿培养技术构建永生化山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)与基质细胞(ESC)共培养体外研究模型,通过ELISA检测性腺激素E2和/或P4对单独培养EEC中TNF-α与TGF-β分泌活性的调节作用以及ESC对该培养体系的影响。结果显示:与未加激素对照组相比,单独或混合添加E2和P4均可显著增加单独培养EEC向顶端分泌TNF-α水平(P<0.05),而对细胞基底端TNF-α分泌活性影响不显著;E2单独作用较对照组显著降低EEC向细胞顶端分泌TGF-β水平(P<0.05),P4单独或与E2共同作用下则主要对单独培养EEC顶端及基底端分泌TGF-β水平具有显著增强作用(P<0.05)。对于EEC-ESC共培养细胞模式,E2和/或P4显著降低EEC顶端和基底端TNF-α分泌水平(P<0.05);EEC顶端TGF-β分泌水平在E2和/或P4作用下显著降低(P<0.05),而EEC基底端TGF-β分泌水平不受激素作用所影响。激素对单独培养及与ESC共培养模式下的极化EEC顶端及基底端TNF-α与TGF-β分泌水平的差异,提示ESC对激素作用下山羊子宫内膜上皮细胞分泌方向及分泌水平的重要调节作用。

Aroclor 1254对小鼠早期胚胎体外发育的影响

【目的】探讨了Aroclor 1254对小鼠2-细胞和8-细胞胚胎体外发育的影响。【方法】在体外培养的小鼠2-细胞和8-细胞胚胎培养液中,分别添加质量浓度为0.05,0.25,1.25和6.25μg/mL的Aroclor 1254,并设Aro-clor 1254溶剂(乙醇)对照组和空白对照组,比较不同质量浓度的Aroclor 1254对小鼠2-细胞和8-细胞胚胎体外发育的影响。【结果】0.05μg/mL Aroclor 1254影响2-细胞胚胎的孵化(57.7%),与溶剂对照组(66.7%)差异显著(P<0.05);0.25μg/mL Aroclor 1254组,2-细胞胚胎的囊胚发育率(72.5%)及囊胚孵化率(23.2%)与溶剂对照组(84.2%,66.7%)差异极显著(P<0.01);1.25μg/mL Aroclor 1254组,2-细胞胚胎发育到8-细胞阶段的比率(32.1%)极显著低于溶剂对照组(P<0.01);6.25μg/mL Aroclor 1254组,2-细胞胚胎发育到4-细胞和8-细胞阶段的比率(58.1%和29.6%)极显著低于溶剂对照组(P<0.01)。0.05μg/mL Aroclor 1254对8-细胞胚胎发育无明显影响;但当质量浓度提高到0.25μg/mL时,Arolor 1254显著影响8-细胞胚胎的孵化(64.7%,P<0.05);1.25μg/mLAroclor 1254组,8-细胞胚胎囊胚发育率(68.6%)及孵化率(25.5%)极显著低于溶剂对照组(92.4%,75.7%)(P<0.01);6.25μg/mL Aroclor 1254组8-细胞胚胎不能继续发育。【结论】Aroclor 1254对小鼠胚胎体外发育存在明显的剂量-毒性关系,随着培养液中Aroclor 1254质量浓度的增加,对小鼠早期胚胎的发育毒性表现越早;胚龄越小,毒性敏感性越强。

Zhangfei融合蛋白的纯化及其免疫效果

【目的】纯化Zhangfei融合蛋白并检测其免疫原性,为研究其在生殖内分泌调节中的作用提供理论依据。【方法】通过大肠杆菌原核表达系统进行Zhangfei融合蛋白的表达,筛选出最佳诱导表达条件,采用SDS-PAGE凝胶检测Zhangfei融合蛋白的表达情况,比较谷胱甘肽琼脂糖凝胶和电洗脱2种纯化Zhangfei融合蛋白的方法,并测定纯化的Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠和家兔的效果。【结果】成功筛选出了表达Zhangfei融合蛋白的最佳诱导条件为IPTG终浓度3 mmol/L,诱导时间7 h;应用电洗脱方法可得到纯度较高的Zhangfei融合蛋白,其质量浓度为1.269 mg/mL,免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5×103以上,免疫兔的血清抗体效价高达1∶3×106。【结论】电洗脱纯化Zhangfei融合蛋白的方法优于谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化法,Zhangfei融合蛋白具有良好的免疫原性。

牛卵胞质内显微受精中第一极体位置与激活方法研究

【目的】探讨牛卵母细胞胞质内显微受精(ICSI)操作中,卵母细胞第一极体位置以及受精卵化学激活方法对ICSI卵体外发育的影响。【方法】采集牛卵巢,成熟培养卵母细胞后,调整其第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置,进行牛卵母细胞胞质内显微受精,以ICSI卵不进行激活处理为未激活组,分别采用乙醇、离子霉素及离子霉素联合6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活ICSI卵,统计ICSI卵的形态完整率、卵裂率和囊胚发育率。【结果】第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置时,所获得的ICSI卵形态完整率(92.9%和94.0%)、卵裂率(37.1%和40.0%)和囊胚发育率(12.9%和12.2%)均无统计学差异(P>0.05)。未激活组ICSI卵的卵裂率较低,不能发育到囊胚;用乙醇或离子霉素激活时,ICSI卵的卵裂率(25.7%和27.6%)和囊胚发育率(3.3%和3.4%)均显著高于未激活组(7.5%和0)(P<0.05);用离子霉素与6-DMAP联合激活时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率分别为38.9%和13.9%,显著高于乙醇激活组、离子霉素激活组及未激活组(P<0.05)。【结论】对牛卵母细胞进行ICSI操作时,第一极体分别位于相当于时钟6点和12点位置时,对ICSI卵的发育无显著影响;采用离子霉素和6-DMAP联合激活,有利于ICSI卵的体外发育。

性腺激素对山羊子宫内膜上皮细胞激素受体表达的影响

为探讨性腺激素对山羊子宫内膜上皮细胞激素受体表达的影响。本研究构建永生化山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)与基质细胞(ESC)体外培养研究模型,通过细胞免疫荧光技术检测性腺激素E2或/和P4对单独培养EEC中PR与ER表达水平的调节作用以及ESC对该作用的影响。结果显示:与未加激素对照组相比,单独添加P4或与E2同时加入均可显著抑制单独培养EEC中PR与ER的表达(P<0.05);而单独添加E2可轻微促进2种激素受体表达水平。在添加有ESC条件培养液的EEC培养模式中,E2单独作用对EEC中PR与ER表达水平无显著影响;P4单独或与E2共同作用下,EEC中PR与ER表达水平均较未加激素对照组显著降低(P<0.05)。性腺激素对单独培养及与ESC共培养模式下的EEC中PR与ER表达水平的调节作用相似,P4对山羊EEC中PR与ER表达水平具有显著抑制作用。

牛体外受精卵与牛胎儿睾丸支持细胞体外共培养研究

【目的】研究牛胎儿睾丸支持细胞对牛早期胚胎的体外发育是否有促进作用。【方法】从屠宰场采集5-7月龄胎牛睾丸，经原代和传代培养制备牛胎儿睾丸支持细胞（sertoli cells，SCs）饲养层，对比原代和传代胎牛睾丸SCs与牛体外受精卵共培养时受精卵的发育情况；分别以4×10^4，2×10^4mL。两个密度接种传代胎牛睾丸SCs与牛受精卵体外共培养，并以培养液中无牛胎儿睾丸SCs饲养层为对照，研究体外牛胎儿睾丸支持细胞（sertoli cells，SCs）对牛受精卵体外发育的影响。【结果】与牛受精卵体外共培养时，接种密度为2×10^4mL^-1传代胎牛睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率（79．3％）高于原代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组（69．2％），但差异不显著（P〉0．05）；囊胚发育率（41．3％）极显著地高于原代SCs饲养层共培养组（16．7％）（P〈0．01）。接种密度为4×10^4mL^-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率大于接种密度为2×10^4mL^-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组，但差异不显著；胚胎发育率极显著地低于接种密度为2×10^4mL^-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组。【结论】制备的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层，能有效促进牛体外受精卵的体外发育，提高囊胚发育率；接种的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层密度过大，将严重影响牛体外受精卵的发育。

两种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚冷冻效果的比较

乙二醇(ETG)和1,2-丙二醇(PROH)具有高细胞渗透性和低毒性特点,常被用于人及多种哺乳动物早期胚胎冷冻保存。为了比较ETG和PROH对小鼠2-细胞胚的冷冻保护效果,本试验分别采用这两种冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚进行冷冻保存,并采用冻后体外培养和囊胚移植进行冷冻效果检测。结果表明,PROH组胚胎解冻后胚胎存活率与ETG组无显著差异,但PROH组4-细胞胚发育率和囊胚发育率显著高于ETG组(82.7%vs.64.6%,61.2%vs.29.1%,P<0.01)。囊胚移植结果表明,2-细胞胚胎冻存后能够发育为正常的后代,PROH组和ETG组的囊胚移植后妊娠产仔率无统计学差异(P>0.05),但均显著低于对照组(P<0.05)。为了分析两组胚胎冻存后损伤情况,对解冻后的胚胎细胞微丝进行检测,结果显示ETG组微丝受损的胚胎数高于PROH组。本研究结果证明采用PROH作为冷冻保护剂冷冻保存小鼠2-细胞胚的冻存效果优于ETG。

山羊子宫内膜基质细胞永生化研究

将真核表达质粒pCI-neo-hTERT通过DNA转染技术导入山羊子宫内膜基质细胞（ESCs）,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定、生长特性及E2、P4等性腺激素的反应性测定。结果,传至2代的山羊ESCs经转染pCI-neo-hTERT,G418筛选2~3周后,抗性克隆形成,滤纸片法转移,扩增并连续培养,共获得5个细胞克隆,扩大培养后的细胞呈典型的长梭形和三角形,相互平行排列成束,与原代培养形态一致。转染后细胞有较高的端粒酶活性,细胞增殖加速,传代时间缩短,传至50代仍稳定增殖。波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性,具有转染前山羊子宫内膜基质细胞特性。雌激素（100 nmol.L-1）和少量孕激素（10 nmol.L-1）对转染后基质细胞增殖有促进作用。获得了永生化的ESCs,为子宫内膜细胞体外研究奠定了基础。

山羊输卵管上皮细胞的分离与培养

【目的】分离并培养山羊输卵管上皮细胞,研究其生长特性。【方法】采用胰酶、胶原酶及机械刮取方法分离输卵管上皮细胞并分析培养效果;选择免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定;向培养液中添加下丘脑粗提物、胰岛素、EGF和血清,探讨其对输卵管上皮细胞体外培养的影响。【结果】胰酶对山羊输卵管上皮细胞的分离效果较差,胶原酶次之,机械刮取方法较好。机械刮取法分离的细胞以细胞团居多,接种后8~12 h开始贴壁生长,生长2~3d细胞呈现明显的铺路石形态。免疫细胞化学染色显示,细胞角蛋白阳性率在95%以上。上皮细胞培养体系中含少量血清及人EGF、胰岛素,能有效促进原代和传代输卵管上皮细胞的生长,以体积分数5%血清＋EGF的培养效果较好。【结论】采用机械刮取法分离培养的输卵管上皮细胞,在体外可连续传到第8代,传代细胞活性强、纯度高,可为输卵管上皮细胞相关功能的研究提供材料。

山羊子宫内膜基质细胞对上皮细胞IL-18分泌活性的调节作用

为了探究性腺激素作用下山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)中白细胞介素-18(IL-18)的分泌活性,以及子宫内膜基质细胞(ESC)对其分泌活性的调节作用。基于套皿共培养永生化山羊EEC和ESC为体外研究模型,通过ELISA和Western blot方法检测E2和/或P4对EEC中IL-18分泌水平的作用以及ESC对该作用的影响。ELISA结果显示,E2较无激素对照组可显著增强单独培养EEC中IL-18的分泌水平(P<0.05),P4单独或与E2联合作用则进一步增强其分泌活性(P<0.01);EEC与ESC共培养模式下,ESC细胞对性激素作用下EEC中IL-18分泌活性具有显著的抑制作用。Western blot结果显示,在单独培养或与ESC共培养模式下,EEC培养上清液中IL-18均以相对分子质量大小18 300的具有生物活性的蛋白形式存在。本研究结果表明,山羊ESC对性腺激素作用下EEC中IL-18的分泌活性具有重要调节作用。