脂肪间质干细胞修复犬关节软骨损伤的研究

以手术方法建立2对共4处犬关节软骨组织损伤;使用无血清细胞培养液为对照,以标记有绿色荧光蛋白的犬脂肪间充质干细胞进行移植治疗试验。病理模型犬进行常规饲养15周后,对病理模型进行取样并系统检测。结果显示,试验组较对照组有更大面积和体积的新生关节软骨组织。新生软骨样组织呈绿色荧光蛋白(GFP)阳性。试验组与对照组的新生组织HE染色显示,试验组的细胞外基质染色较对照组更加均一,基质切面更加平整光滑。透明软骨的标志性基因COL2a1的免疫荧光染色显示,试验组可见较强的COL2a1阳性染色,而对照组仅有少量微弱的阳性染色。实时荧光定量PCR检测结果显示,试验组的COL2a1含量显著高于对照组(P<0.05)。试验结果表明,直接移植原代犬脂肪间充质干细胞到关节腔可有效修复犬软骨组织缺损,为干细胞治疗临床软骨组织损伤提供了科学依据。

米托蒽醌甲磺酸盐预处理脂肪间充质干细胞对犬糖尿病的治疗效果评价

本研究在高脂饮食(high-fat diet, HFD)饲喂和链脲佐菌素(streptozotin, STZ)注射的联合作用下成功建立小鼠及犬糖尿病模型,旨在探究米托蒽醌甲磺酸盐(mitoquionl mesylate, MitoQ)预处理脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)对糖尿病动物模型治疗效果的提升作用及机制。取正常培养状态的ADMSCs及添加1μmol·L^(-1)MitoQ处理的ADMSCs,对MitoQ处理的细胞形态变化、生长、增殖、迁移及抗氧化能力等进行检测。选取48只8周龄的昆明(KM)雄性小鼠和12只中华田园犬,随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病模型组(Diabetes组)、ADMSCs单独治疗组(ADMSCs组)和MitoQ预处理ADMSCs联合治疗组(MitoQ-ADMSCs组)。常规方法制作小鼠及犬糖尿病模型,对模型小鼠和犬分别进行ADMSCs和MitoQ-ADMSCs细胞静脉移植治疗,细胞数为2×10^(6)·只^(-1)(小鼠)和1×10^(7)·只^(-1)(犬),每周1次,连续3周。持续监测临床指标变化,治疗结束后1周收样,血清学、组织学、氧化应激及犬血清代谢组学分析。结果表明,MitoQ预处理ADMSCs不会影响其细胞形态,但能促进其生长、增殖及迁移能力,同时增强其抗氧化能力;ADMSCs和MitoQ-ADMSCs移植治疗后,发现MitoQ显著促进ADMSCs降低血糖的能力,且提高胰岛β细胞功能和机体血糖调节能力;ADMSCs经MitoQ预处理后有效减轻糖尿病伴发的肝代谢功能障碍和血脂代谢异常;ADMSCs可以减轻胰腺和肝组织损伤,促进胰岛素分泌,减轻肝糖原合成障碍和纤维化水平,而MitoQ处理能够显著改善ADMSCs治疗效果;MitoQ预处理ADMSCs能够有效提升机体的抗氧化能力,减轻氧化损伤,进而增强治疗效果;MitoQ预处理ADMSCs可以显著促进机体内与抗氧化相关的代谢物表达上调。结果揭示,MitoQ能够通过提高ADMSCs的抗氧化能力、加速组织损伤修复,从而更好地治疗小鼠及犬糖尿病。

用新型间充质干细胞制剂治疗猫创口延迟愈合

创伤后皮肤破裂或手术后皮肤创口都可能导致伤口(或切口)延迟愈合。身体是一个不断代谢的有机体,有自己的调节机制,皮肤损伤后的愈合时间也会遵循同样的规律。如果伤口愈合过程受到负面影响,则可能导致伤口延迟愈合。伤口出现延迟愈合的原因包括感染、药物、异物存留、损伤严重、营养不良、疾病、组织对合不良、年龄因素、皮肤缺损、自体敏感、脂肪液化、皮下积液等。研究建立了一种直接注射的间充质干细胞(MSCs)制剂,用于治疗1例由自体敏感导致的猫创口延迟愈合。治疗后21 d,伤口完全愈合。MSCs的局部植入成功促进了溃烂伤口的皮肤再生,并促进了毛发再生。研究结果为进一步推动干细胞治疗宠物疾病提供了切实可行的治疗剂型并提供了良好的治疗案例。

LIN28调控哺乳动物干细胞和生殖细胞发育分化的研究概述

Lin28为一种保守的RNA结合蛋白质,在细胞代谢、细胞周期和多能性维持中具有重要调控作用。近年来,发现Lin28在哺乳动物原始生殖细胞形成和分化、精原干细胞的形成、自我更新和分化调控中具有不可替代的作用。本文对Lin28作用及其对哺乳动物干细胞和生殖细胞发育分化影响的研究进展作一简述。

成年昆明小鼠雄性生殖干细胞的分离培养及其多能性研究

【目的】从成年昆明小鼠睾丸组织中分离具有多能性的雄性生殖干细胞(Male germline stem cells,mGSCs)。【方法】采用机械法和2步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞,经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,2周后得到类胚胎干细胞(ESCs)样mGSCs。对得到的mGSCs进行碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、RT-PCR、体内分化等检测。【结果】mGSCs具有类似ESCs的形态和多能性,AP染色呈阳性,免疫荧光Oct4、Vasa染色呈阳性,RT-PCR检测其表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因和Vasa、C-kit等生殖细胞的标记基因,在免疫缺陷鼠体内能形成畸胎瘤,组织学检测其可形成包括3个胚层在内的多种类型细胞。【结论】从成年昆明小鼠睾丸分离的精原细胞,在体外培养去分化形成了具有类ESCs生物学特性的mGSCs,mGSCs既具有多能性,也具有生殖细胞的基本生物学特性。

PLZF与哺乳动物雄性生殖干细胞的发育分化

早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger,PLZF),也被称为ZBTB16(zinc finger and BTB domain containing 16,ZBTB16)或锌指蛋白145(zinc finger protein 145,ZFP145),是我国学者发现与人类疾病相关的蛋白质.人类PLZF的是由673个氨基酸残基组成的转录抑制因子,属于蛋白质超家族.该超家族以N端的BTB/POZ(bric-à-brac,tramtrack,brad complex(BTB)/poxvirus zinc finger(POZ)domain)结构为特征.PLZF蛋白的BTB/POZ结构与个体发育、胚胎发生、染色体的重构等事件相关.近年发现,PLZF在哺乳动物雄性生殖干细胞(male germline stem cells,mGSCs)发育分化过程中也发挥重要作用.探讨PLZF的生物学功能和作用机制,将有助于理解其在mGSCs发育过程中的重要作用.本文就PLZF在维持mGSCs自我更新和在发育分化调控中的作用给予综述.

TGF-β通路与哺乳动物卵母细胞发育研究进展

转化生长因子β(TGF-β)信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子的大家族,其在卵母细胞形成和发育方面发挥重要的作用。TGF-β信号通路主要是通过配体与受体结合形成复合物,从而激活相关分子调控关键基因的表达。这一系列过程包括直接参与调控作用的骨形成蛋白(BMPs)、激活素(activins)、抑制素(inhibin)、TGF-β和抗苗勒管素(AMH)。另外,还通过偶联环腺苷酸(cAMP)、激素和表皮生长因子(EGF)三个主要途径间接影响TGF-β通路对卵母细胞的发育。论文通过综述TGF-β通路对哺乳动物卵母细胞发育影响的研究进展,为相关研究提供参考。

内质网应激对哺乳动物卵母细胞成熟的影响研究进展

在卵母细胞成熟过程中以及胚胎着床前,具备特定功能的各类蛋白质必须在内质网(endoplasmic reticulum,ER)中完成折叠与修饰,这对于维持卵母细胞成熟和胚胎发育是至关重要的。然而,外界不良因素的刺激会破坏内质网功能,阻碍蛋白质合成,诱发ER应激和未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),适当的应激反应有利于细胞恢复功能。卵母细胞和早期胚胎对各类外源刺激高度敏感,多项研究表明ER应激和UPR信号影响卵母细胞成熟和胚胎着床前发育。论文总结了ER应激、UPR信号通路及其在哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎着床前发育中的作用和机制的现状,以期为卵母细胞体外发育成熟及人类生殖临床提供借鉴。

小鼠卵母细胞和胚胎不同冷冻方法的比较研究

探讨程序化冷冻与玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎的复苏率及其发育潜能的影响。通过小鼠的卵母细胞与早期胚胎的不同冷冻方法的比较,为后续阿旺绵羊的胚胎冷冻保存提供参考。采用程序化冷冻与玻璃化冷冻技术,分别冷冻小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎,复苏后培养,比较不同冷冻处理后的复苏率、成熟率与囊胚率。小鼠GV期卵母细胞程序化冷冻复苏率(48.00%±5.29%)显著低于玻璃化冷冻复苏率(65.00%±5.00%),有统计学差异(P=0.0147<0.05);而程序化冷冻后复苏卵母细胞的发育成熟率略高于玻璃化冷冻组,但无统计学意义。小鼠二细胞期胚胎程序化冷冻组复苏率(76.00%±2.00%)显著高于玻璃化冷冻组复苏率(70.00%±2.00%),有统计学差异(P=0.0213<0.05);冷冻后复苏胚胎发育的囊胚率程序化冷冻略低于玻璃化冷冻及对照组,但无统计学意义。

奶山羊骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】分离、培养奶山羊骨髓间质干细胞(MSCs),探讨其生物学特性,为心血管、神经退化,尤其是不育症患者的细胞移植治疗及相关细胞发育分化研究奠定基础。【方法】采用贴壁培养法进行MSCs的分离和培养,通过形态学观察、生长曲线测定、免疫细胞化学染色和RT-PCR技术等进行检测;并采用免疫细胞化学法对自发分化的细胞及定向诱导分化的神经样细胞、心肌样细胞、生殖样细胞进行检测,计算生殖样细胞的阳性率。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,其增殖能力强,无致瘤性,已连续传代至22代;其表达胚胎干细胞(ESCs)的表面标记Oct4、Nanog、C-myc和TERT;MSCs形成类胚体自发分化的细胞表达3胚层特异标志基因AFP、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;MSCs经β-巯基乙醇诱导,定向分化为表达Nestin和β-ⅢTubulin的早期神经样细胞,经5-氮胞苷(5-Aza)诱导,可定向分化为表达CT3及心肌α-actin的心肌样细胞,并出现肌管样结构,经维甲酸(RA)诱导,分化的细胞表达生殖细胞减数分裂前期的蛋白Vasa、Scp3和CD49f(α6整合素)等生殖细胞标记,其阳性率分别达到35.7%,24.0%和14.0%。【结论】自奶山羊骨髓分离得到MSCs,其具备间质干细胞的基本特性,并具有向神经细胞、心肌细胞、生殖细胞分化的潜能。

雄性关中奶山羊胎儿生殖细胞增殖分化的研究

旨在阐明山羊胚性腺的发生规律,这对于山羊的繁殖育种、丰富胚胎学有关研究内容都具有重要意义。该研究对22枚从39日胎龄胎儿至初生奶山羊性腺进行石蜡组织切片,用组织学和免疫组化、免疫荧光方法对山羊胎儿性腺发育的组织学特点,山羊胎儿性腺发育过程中VASA及细胞增殖核抗原(PCNA)的表达规律进行了系统研究。结果表明:奶山羊性腺在39～47日胎龄时已出现精索和白膜,已发生性别分化,并可分辨出生殖细胞、支持细胞及间质细胞,细胞增殖率较高。在大约50日胎龄前生殖细胞可称作性原细胞,细胞为球形、核质比高。在51～59日胎龄,生殖细胞发生剧烈变化:体积增大、核质比降低。此后逐渐由性原细胞发育为前精原细胞,并且在此期间表达VASA的生殖细胞增多。50～90日胎龄,生殖细胞增殖率最高,生殖细胞所占比例也达到峰值。在90日胎龄后生殖细胞增殖率下降,比例下降,间质细胞大量退化。结果表明,山羊胎儿的生殖细胞在50日胎龄后由性原细胞发育为前精原细胞,生殖细胞在50～90日胎龄的增殖率最高,VASA可作为雄性山羊胎儿前精原细胞的标记。

Figla基因过表达促进小鼠胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化

生殖系a因子(Figla)是最早表达的生殖细胞特异性转录因子之一,对卵泡的发育、Zp基因的表达和透明带的形成具有调节作用.Figla基因异常会引起卵巢早衰的发生.本研究通过PCR自小鼠基因组中扩增出Figla基因,将其克隆到真核报告载体pDsRed1-N1,构建了携带609 bp的Figla重组载体pDsRed1-N1-Figla.用该载体转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)系J1、小鼠成纤维细胞系NIH-3T3、小鼠畸胎瘤细胞P19和小鼠精原细胞系GC1,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)在细胞中的表达,同时检测转染细胞中Figla基因及其它生殖细胞特异性基因的表达.结果显示,转染2 d,mESCs内Figla总表达量明显增加,且内源性表达量亦有所提高,即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达.免疫荧光染色显示,表达RFP的细胞同时表达生殖特异性基因Vasa,减数分裂特异性基因Stra8、Scp3及卵母细胞标志基因Zp3.通过QRT-PCR检测发现,在转染3 d的细胞中,Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组均有明显上调,而Oct4和Stra8的表达量下降.研究表明,Figla基因对生殖特异性基因的表达具有调控作用,可以激活雌性生殖基因表达,为更清楚地了解Figla基因在生殖细胞生长发育过程中的调控机制,以及发现该基因在生殖细胞中的新功能奠定了基础.

MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化中的作用

microRNA(miRNA)在奶山羊雄性生殖细胞和精子发生过程有重要的调控功能。为研究miR-34c对雄性生殖干细胞增殖与分化中的作用,本文利用视黄酸效应基因8(Stra8)在雄性生殖细胞中随年龄增长,以其表达量上调的表达特征为指针,使用实时定量PCR技术筛选分析miRNAs。结果发现,miR-34c与Stra8的表达规律基本一致。在无精症奶山羊的睾丸组织中,发现miR-34c在无精症奶山羊睾丸组织中表达缺失。利用miR-34c模拟物及抑制剂转染奶山羊雄性生殖干细胞,体外转染miR-34c模拟物及其抑制剂,发现miR-34c能够下调Rarg、Stra8与c-Myc基因的表达,减缓奶山羊雄性生殖干细胞的增殖。结果提示,miR-34c可能具有调控奶山羊雄性生殖干细胞的减数分裂的作用,同时抑制其增殖。

miRNAs与哺乳动物生殖细胞发生

随着小RNA组学的兴起，越来越多不曾被关注的小RNA分子，如siRNAs，miRNAs，rasiRNAs和piRNAs等先后被发现。研究显示，相对于基因、蛋白质等具有复杂结构的生物大分子而言，这些结构非常简单的微型RNA对动物正常机能的维持、细胞增殖、分化、凋亡、器官形成、肿瘤形成等各种生命现象都具有极其重要的影响。

MiR-302/367在体细胞向多能性干细胞重编程中的作用

MicroRNA-302／367（miR-302／367）发现于2003年，是一类长度在21～22nt的miRNA簇，与多能性干细胞自我更新及多向分化有重要关系．在体细胞向多能性干细胞重编程中具有重要作用．miR-302／367簇中各miRNA具有相对保守的种子区及靶基因，主要通过抑制靶基因蛋白质的翻译，从而促进间质．上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET）、抑制细胞周期、调控细胞分化相关基因及表观遗传水平等方式促进体细胞向多能性细胞重编程．本文对miR-302／367的发现、结构、miR．302／367在多能性细胞中的作用及在体细胞向多能性干细胞重编程中的作用及其机理等做一综述．

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示:miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。

自噬在发育及干细胞中的作用

自噬是亚细胞膜结构发生动态变化并经溶酶体介导的细胞内蛋白质和细胞器降解的过程。通过平衡细胞内的合成和分解代谢,自噬可以维持细胞内环境稳态。干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,对组织器官再生和维持组织稳态有重要作用。近年的研究表明,自噬在维持干细胞功能方面有非常重要的作用,本文综述了自噬的形成过程和分子机制及其在发育及干细胞中的作用。

诱导人脐带间充质干细胞向心肌细胞分化及对小鼠心肌梗死的治疗作用

目的研究脐带间充质干细胞(UC-MSC)体外分化为心肌细胞的可行性以及观察UC-MSC体内移植对心肌梗死模型小鼠的治疗效果。方法 10μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)体外诱导UC-MSC 14 d,通过RT-PCR、免疫荧光染色鉴定其分化效果;采用腹腔注射盐酸异丙肾上腺素(ISO)每只3.0 mg/(kg/d),制作心肌梗死模型鼠;在注射ISO 48 h后,实验组将DAPI标记的UC-MSC经两次尾静脉移植给心肌梗死模型鼠,移植后第4周和第8周,分别采集实验小鼠的心脏、脾脏,以未移植细胞组的小鼠心肌损伤模型作为对照,通过心脏指数和脾脏指数测量,免疫荧光和碱性复红-苦味酸(HBFP)染色鉴定其体内分化和修复作用。结果 RT-PCR分析表明诱导的UC-MSC表达心肌特异性基因:心肌α-actin、TBX5、GATA4和NKx2.5,免疫荧光染色显示诱导细胞呈心肌α-actin和NKx2.5阳性,且呈双核现象。尾静脉移植后第4周和第8周,模型受体鼠心脏均发现有DAPI阳性细胞迁移至心肌组织且呈现心肌α-actin阳性,HBFP染色及心脏和脾脏指数结果显示移植UC-MSC对心肌损伤的模型鼠有明显的修复和治疗效果。结论 UC-MSC在体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞,尾静脉体内移植UC-MSC对心肌损伤小鼠有明显的治疗效果。

表观遗传学与生殖细胞发育分化研究发展

从DNA甲基化修饰、组蛋白甲基化和乙酰化修饰、基因印记和RNA干扰等几个方面,综述了表观遗传学的基本机制及其对哺乳动物生殖细胞发育分化的影响。表观遗传学对于动物机体生长、代谢及功能的正常维持具有重要作用,其中任何方面的异常都会导致体细胞和生殖细胞的生长分化调控失常,甚至引发疾病。

诱导型细胞的研究进展

胚胎干细胞(ES细胞)和诱导型多能干细胞(iPS细胞)的研究进展为生物学基础研究注入了新的活力,然而免疫排斥、致瘤性以及诱导效率低等缺陷制约其进一步快速发展和临床应用.最近,科学家借鉴iPS细胞诱导技术和传统的诱导体系,将终末分化细胞直接诱导为功能性细胞,如心肌细胞、神经细胞和肝脏细胞,称为诱导型细胞.这些研究进展极大地促进了细胞分化、重编程和表观遗传学的研究,也为人类再生医学的研究提供了新的途径.