影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式 ,以高糖DMEM ,添加 0 .1mM2 -巯基乙醇、犊牛血清、细胞因子为培养基 ,以 4～ 13周龄屠宰牛胎儿为实验材料 ,探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素。结果发现 :当犊牛血清为 15 %时效果最好 ;细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著 ,而在传代过程中有一定影响 ;以 0 .2 %胰酶 +0 .0 4 %EDTA为细胞消化液效果最佳 ;以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆牛胚胎干细胞 。

胚胎干细胞生物学特性及其应用前景

胚胎干细胞是来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞的一类未分化的全能性多能性干细胞，具有无限增殖和全能分化的潜力。胚胎干细胞在发育生物学基础研究、动物胚胎工程研究生产和临床医学上具有诱人的应用前景。

某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响

以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 +0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 +10 μg/L IGF+10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。

奶牛早期胚胎死亡的因素分析及防制措施

奶牛妊娠失败主要发生在配种后的40d,染色体异常和激素失调等内源性因素和热应激、营养等环境因子,均是引起胚胎死亡的原因。激素治疗,提高P4的浓度或补充bTP—1,在一定程度上可以提高奶牛的妊娠率,改善公母畜的饲养管理条件,满足家畜对维生素及微量元素的需要,并保证优良条件,以提高配子的质量,使早期胚胎得到正常的发育。本文从早期胚胎发育、母胎识别、影响胚胎死亡率的因素及预防、治疗等方面进行综述。

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到

支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 +0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3+0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 +1 5 % NBS,有利于 MEF和

胚胎干细胞体外定向诱导分化研究进展

胚胎干细胞是由早期内细胞团分离的一种多潜能细胞 ,在体外分化抑制培养时 ,可保持未分化状态而无限增殖。一旦撤除分化抑制因素 ,或添加适当的诱导剂 ,ES细胞可分化为内胚层、中胚层和外胚层的多种类型的特化细胞。文章综述了体外定向诱导 ES细胞分化为造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞和黑素细胞等的途径和方法。

添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响

研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离和克隆 ;在 ES细胞培养液中 ,犊牛血清体积分数以 15 %～ 2 0 %为宜 ,在 DMEM(L )培养液中添加 0 .1μm ol/ L Na2 Se O3+0 .1mm ol/ Lβ-巯基乙醇 +10 ng/ m L IGF+10 0 0 ng/ m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;低糖 DMEM比TCM199和高糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离。优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在37℃用低体积分数消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 。

哺乳动物胚胎干细胞的研究历史和现状

与胚胎细胞相比 ,胚胎干细胞占有数量优势 ,与体细胞相比 ,则有低分化的优势。本研究在综述哺乳动物胚胎干细胞研究历史的基础上 ,概述了胚胎干细胞的分离方法和存在的问题。

由牛体外受精胚胎分离胚胎干细胞

以 DMEM+1 5% NBS+0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 +0 .1μmol/ L亚硒酸钠 +1 0μg/ L LIF+1 0μg/ LIGF-1作为培养液 ,以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层 ,利用 8日龄牛体外受精胚胎获得了传 3代的牛类胚胎干细胞 (类 ES细胞 )。通过体外分化试验 ,对所得类 ES细胞的多能性进行了鉴定。结果在培养 2 d后 ,牛类 ES细胞分化形成了类似于扩张囊胚的结构 ,悬浮于培养液中。

哺乳动物胚胎干细胞相关细胞因子研究进展

影响哺乳动物胚胎干细胞克隆的细胞因子可分为分化抑制因子和生长因子两大类。分化抑制因子包括白血病抑制因子 (LIF)、腺病毒E1A样激动剂A等。生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、干细胞因子 (SCF)、胰岛素样生长因子 - 1(IGF - 1)、forskolin等。

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

比较了添加 L IF,IGF- 1和 L IF+IGF对牛胚胎干细胞 (ES)分离的影响。结果表明 :1添加10 ng/m L L IF能提高胚胎贴壁率 ,促进内细胞团 (ICM)和 ES细胞的增殖并抑制其分化 ;2添加 10 ng/m L IGF- 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使 ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;3添加 10 ng/m L L IF+10 ng/m L IGF- 1,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利于牛胚胎干细胞的分离。

胚胎早期死亡的因素分析

引起胚胎早期死亡的因素很多。如配子发生过程中的潜在异常、胚胎内在缺陷、母胎识别建立的失败、母体环境异常等。本文从配子发生、胚胎发生、母胎关系建立、母体环境等方面对胚胎早期死亡的因素进行分析。

布尔山羊胚胎移植技术的研究与应用

1999年 10～ 11月份 ,分三批使用阴道栓 +FSH超数排卵供体布尔山羊 (Boergoat,下同 ) 13只。在放入阴道栓的第 8～ 10天 ,连续三天递减量肌肉注射FSH (澳大利亚 ) 32 0mg。 9只供体羊发情、配种、采胚 (有效率 6 9 2 3% ,9/ 13) ,平均采胚数 18 11枚± 5 18枚 ,其中可用胚平均数 15 4 4枚± 6 31枚 (可用胚率 85 2 8% ,139/ 16 3)。将 139枚 7日龄可用胚移植受体关中奶山羊 89只 ,妊娠 5 0只 ,妊娠率 5 6 18%。其中鲜胚移植妊娠率 6 1 11% (4 4/ 72 ) ,冻胚移植妊娠率 4 1 6 7% (5 /12 ) ,二分割胚移植妊娠率 2 0 % (1/ 5 )。 5 0只妊娠受体羊共产羔 6 8只 ,每只供体羊平均获羔羊 7 5 6只。供体羊采胚后 ,平均 39 9天发情 ,配种 ,全部妊娠产羔 ,平均产羔 2只。胚胎移植羔羊性别、初生重、发病率和布尔羊自繁羔羊无显著差异 ,P >0 0 5。本次布尔山羊胚胎移植产生明显的经济效益 ,技术成熟 ,可推广应用 ,逐步产业化。

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

本文研究比较了添加LIF、IGF - 1和LIF +IGF - 1对牛ES细胞分离的影响。结果表明 :①添加 1 0ng/mlLIF能提高胚胎贴壁率 ,促进ICM和ES细胞和增殖并抑制其分化 ;②添加 1 0ng/mlIGF - 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;③添加 1 0ng/mlLIF + 1 0ng/mlIGF - 1 ,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利用牛胚胎干细胞的分离。因此 ,我们认为 ,在牛ES细胞的分离过程中 ,添加适量LIF和IGF -

成年山羊皮肤干细胞体外克隆与诱导分化

目的 探索山羊皮肤干细胞的分离方法与培养体系 ,为进一步研究皮肤干细胞增殖分化的分子机制打下基础。 方法 从成年关中奶山羊耳尖获取皮肤 ,用组织块培养法分离皮肤干细胞 ,碱性磷酸酶 (AL P)染色及体外分化实验鉴定 ,用条件培养基与细胞因子相结合行皮肤干细胞的体外诱导分化。 结果 山羊耳尖皮肤分离得到类干细胞集落并传 5代 ,细胞集落具有典型鸟巢状结构 ,AL P染色阳性 ,体外分化能形成类胚体。在细胞因子 (IGF- 1)及条件培养基的诱导下 ,所分离获取的皮肤干细胞能分化形成类毛囊 ,类星形胶质细胞及类成骨细胞。 结论 用组织块培养法可以获得多能性皮肤干细胞 ;在体外培养条件下不仅能进行定向分化 ,还能进行横向分化。

奶牛隐性乳腺炎病原菌的分离鉴定

从2002年10月起,应用LMT从西安及其周边地区184个乳区的1000头奶牛中抽取了48头,进行奶牛隐性乳腺炎的调查及病原菌的分离鉴定。结果西安及其周边地区患隐性乳腺炎奶牛占总头数的66.7%,患隐性乳腺炎乳区占总乳区的35.4%。4个乳区全阳性者占15.2%。共检出细菌67株,其中金黄色葡萄球菌占总检出菌41.8%。链球菌占总检出菌29.9%。G+杆菌与G-杆菌各3株,分别占总检出菌4.5%。

CD58与山羊早孕因子之间关系的研究

应用猪淋巴细胞Ea花环抑制试验 ,建立了山羊EPF测定的方法 ,检测了山羊妊娠早期血清中EPF的活性并对EPF与CD5 8的活性关系进行了研究。结果证明 :猪淋巴细胞Ea花环抑制试验可应用于山羊EPF活性的测定 ;妊娠早期 ( 1～ 2ld)山羊血清中存在EPF活性 ,第 1,8d有活性峰值 (RIT值分别为 18 8± 1 1,2 1 2± 1 8) ,其余时间EPF活性相对稳定 ,呈现一定规律性变化 ;CD5 8( 1∶10 0 )孵育淋巴细胞后 ,RIT值显著高于HBSS液对照组(P <0 0 5 ) ,CD5 8( 1∶2 ,1∶10 )孵育淋巴细胞后 ,RIT值极显著高于HBSS液对照 (P <0 0 1) ,认为CD5 8活性可以用Ea花环抑制试验进行测定并具有与EPF协同抗淋巴细胞血清使RIT值升高作用相似的功能 ;妊娠山羊血清经CD5 8,CD2 ,HBSS液等处理后孵育淋巴细胞 ,经CD5 8处理组RIT值极显著高于HBSS液处理组 (P <0 0 1) ,经CD2处理组RIT值极显著低于HBSS液处理组 (P <0 0 1)而与HBSS液对照组差异不显著 (P >0 0 5 ) ,表明CD5 8与EPF可共同协同抗淋巴细胞血清抑制Ea花环形成 ,CD2对EPF有一定程度的封闭作用。进一步认为CD5 8与EPF具有一定程度的抗原交叉性。

牛卵泡卵母细胞的体外成熟培养

1997- 12～ 2 0 0 1- 0 8共进行了 97批牛卵母细胞体外成熟试验 ,总成熟率为 70 .75 % (35 6 1/ 5 0 33)。其中培养液为 TCM199+0 .12 g/ L 丙酮酸钠 +10 mm ol/ L Hepes+体积分数 8% NCS+10 mg/ L FSH+10 mg/ LL H+1mg/ L E2 (培养液 1组 )组进行 5 0批试验 ,成熟率为 6 5 .75 % (14 15 / 2 15 2 )。培养液 1组有 5批次未添加 Hep-es 盐 ,其成熟率为 75 .2 1% (88/ 117) ;另 4 5批次添加 Hepes盐 ,成熟率为 6 5 .2 1% (132 7/ 2 0 35 )。培养液为TCM199+体积分数 8%发情牛血清 +0 .12 g/ L 丙酮酸 (培养液 2组 )组进行 4 7批次试验 ,成熟率为 74 .4 9%(2 14 6 / 2 881)。培养液 2组中有 9批次添加了 4 0 m g/ L 的庆大霉素 ,其成熟率为 72 .15 % (342 / 4 74 ) ;另 38批次未添加庆大霉素 ,其成熟率为 74 .95 % (180 4 / 2 4 0 7)。试验同时表明 。