核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析

谷胱甘肽转移酶GST基因在植物逆境响应中具有重要作用。核桃Juglans regia是重要的经济林木,其生长和产量受环境因子的影响。为探索核桃抗逆生理机制,筛选抗逆基因,以品种‘香玲’‘Xiangling’为试材,克隆获得核桃JrGSTU23基因,并进行生物信息学和基因表达分析,预测JrGSTU23的基本生物功能。结果显示:JrGSTU23基因的开放阅读框(ORF)为684 bp,编码多肽为25.89 kDa,包含氨基酸227,理论等电点为5.20。与碧桃Prunus persica,毛果杨Populus trichocarpa等同源蛋白进行多序列比对,发现均有GST-Tau保守结构域,且与香蕉Musa acuminata和毛果杨等的Tau家族GST蛋白具有较近的进化关系;其上游2 000 bp启动子中含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)发现,JrGSTU23在植物激素脱落酸(ABA),茉莉酸(MeJA),水杨酸(SA)和非生物胁迫氯化钠,聚乙二醇(PEG 6000),6℃等胁迫下能不同程度地被诱导表达,且在根和叶中的表达趋势不同。表明JrGSTU23受不同植物激素和非生物胁迫诱导,且具有组织表达特异性,推测其在核桃逆境响应中起到一定作用。

核桃TT1类转录因子的筛选及干旱响应分析

TT1基因(transparent testa1)在植物逆境响应中有重要作用。核桃是重要的经济树种,其产量和质量均受环境影响。为进一步探索核桃(Juglans regia)抗逆机制,以‘香玲’核桃为试验材料,克隆获得核桃JrTT1基因,并进行基因表达和生物信息学分析,预测该基因的基本生物功能。结果表明,JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因的开放阅读框(OFR)分别为1014、1023、1029 bp,蛋白分子量分别为37763.51、38492.94、38136.36 u,含有氨基酸数分别为337、340、342,理论等电点分别为7.88、7.19、8.89。与其他物种的同源TT1蛋白具有较近的进化关系。且其上游1200 bp启动子中含有多种与干旱逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因在PEG 6000胁迫下能不同程度地被诱导表达,且在叶和根中的表达趋势不同。表明JrTT1基因可以响应干旱胁迫诱导,并具有组织表达特异性,推测其在核桃逆境响应中具有一定作用。

核桃JrGRAS2基因响应热胁迫的表达及功能分析

GRAS转录因子在植物响应逆境中起重要作用。为更好的了解核桃(Juglans regia)在逆境胁迫下的适应机制,本研究从‘香玲’核桃转录组中克隆获得一条GRAS基因(命名为Jr GRAS2),对其在不同高温胁迫下的表达进行分析,并将该基因插入酵母表达载体p YES2中构建重组载体p YES2-Jr GRAS2,将p YES2-Jr GRAS2转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSCI,同时以转化p YES2的重组酵母作为阴性对照,在酵母表达系统中研究该基因的抗热胁迫功能。结果显示,该基因开放读码框(ORF)全长1 296 bp,拟推导的蛋白分子量为47 405.83 Da,含有氨基酸数为431,理论等电点为5.66。在热胁迫下,Jr GRAS2基因被显著诱导,特别是在36℃胁迫0.5 h的茎内,其表达相对于对照被上调了335.5倍。对两种酵母进行热胁迫,发现转Jr GRAS2基因酵母表现出较对照更高的生存活性。表明Jr GRAS2基因具有响应热胁迫的能力,且能提高酵母的抗性,Jr GRAS2基因可作为核桃逆境应答的重要候选基因。

核桃V-ATPase c亚基基因(JrVHAc4)的克隆和抗旱功能分析

【目的】V-ATPase是植物逆境响应的重要酶,有必要了解V-ATPase相关亚基参与核桃响应逆境胁迫的功能机制。【方法】从‘香玲’核桃转录组中克隆获得1条V-ATPase c亚基基因(命名为JrVHAc4),通过分析启动子预测其逆境响应功能。对JrVHAc4基因进行干旱胁迫下的表达分析,同时构建JrVHAc4酵母表达载体转入酵母表达系统研究其抗旱功能。【结果】JrVHAc4基因开放读码框(ORF)全长495 bp,拟推导的蛋白分子量为16 527.61 u,包含164个氨基酸,理论等电点为8.62;其上游1 047 bp启动子包含MYC、DOF、MYB等与干旱响应相关的顺式作用元件。干旱胁迫下,JrVHAc4基因在核桃叶和根中均被显著诱导,并存在差异。对JrVHAc4转基因酵母进行不同浓度甘露醇胁迫,与对照酵母相比,发现JrVHAc4基因的表达能显著提高转基因酵母的生长活性。【结论】JrVHAc4基因能响应干旱胁迫,并能提高酵母的抗旱能力,JrVHAc4可作为核桃抗逆重要候选基因。

核桃JrERF2-2基因克隆及其对逆境的响应

【目的】核桃(Juglans regia)是我国重要的木本粮油战略及扶贫攻坚树种,其生长发育受不良环境条件制约,但目前核桃响应逆境的适应机制尚不明确,影响了核桃产业的科学管理,妨碍了核桃产业综合效益的提高。该研究筛选优良抗逆候选基因,以揭示核桃抗逆适应机制。【方法】以"Ethylene Response Factor"为关键词在’香玲’核桃转录组中筛选ERF转录因子家族成员,经同源比对、开放读码框(ORF)、序列基本特征、PCR克隆等分析后选取其中的JrERF2-2进行基本生物信息及逆境表达分析。胁迫包括盐(NaCl)、干旱(PEG6000)及脱落酸(ABA)处理。【结果】JrERF2-2基因的ORF长906 bp,编码蛋白含262个氨基酸,分子质量为74.43 ku,理论等电点为5.07,与白桦(Betula platyphylla)、欧洲栓皮栎(Quercus suber)的ERF蛋白具有较近的亲缘关系,其上游1455 bp启动子中含多种逆境相关顺式作用元件,如干旱早期响应元件(ACGTATERD1)、热胁迫响应元件(CCAATBOX1)、低温响应元件(LTRE1HVBLT49)等。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,JrERF2-2在NaCl、PEG6000、ABA处理下均可被诱导表达,且在胁迫后不同时期表达程度不同。【结论】JrERF2-2受ABA和渗透胁迫诱导,在植物逆境响应中具有一定作用,是核桃逆境适应机制研究的重要候选基因。