浅谈新形势下加强分子生物学实验室安全管理

本文对分子生物学实验室的安全隐患进行分析,探讨分子生物学实验室安全管理措施,并总结了实验室废弃物的处理方法,力求使分子生物学实验室安全隐患降到最低。

建兰花叶病毒的分子生物学检测

根据建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计2对引物,采用IC-RT-PCR方法和质粒梯度稀释的方法,研究建兰花叶病毒的分子检测方法和灵敏度。结果表明,从21个建兰花叶病毒的病株样品中均能扩增出与预期大小相同的DNA条带,序列测定和序列同源性分析表明所测定的序列均为CyMV外壳蛋白基因的部分序列,序列同源性均达到89%以上;灵敏度检测结果表明:可检测的最低病毒含量为2.72×10-7μg/mL。

冷冻离心机在分子生物学中的应用和保养

冷冻离心机在高校分子实验中应用广泛，几乎渗透到分子生物学的各个领域，在教学和科研中发挥着重要作用。对实验室中的高效冷冻离心机加强日常维护、使用和保养，对出现的事故及时进行分析，采取有效措施及时排除故障，这对提高该设备的使用效率和延长寿命发挥着重要作用。本文以Avanti J-E高效冷冻离心机为例，对冷冻离心机在使用过程中的注意事项和保养方面提出一些可行性建议。

陕西苹果树腐烂病菌(Cytospora spp.)不同分离株的生物学特性与致病性研究

本研究从陕西分离得到61株苹果树腐烂病菌(Cytospora spp.),选取在PDA培养基上菌落特征差异明显的7个分离株,对其生物学特性及致病性进行研究。结果表明:各分离株在PDA、PSA、PMA和PEMA培养基上菌落生长较好,但在PDA上的菌落颜色和产孢情况差异很大。各分离株均能在5～32℃生长,但对35℃以上高温的适应性差异较大;所有分离株均能在pH4～9的条件下生长,最适pH为5～6;光照对各分离株的菌落生长有明显的促进作用。各分离株均可在Cza-pek培养基及供试的其它碳、氮源培养基上生长,其中以葡萄糖、麦芽糖和酵母膏为最佳碳、氮源。采用烫伤接种的方法,分别以菌饼和分生孢子悬浮液接种苹果离体枝条,两者均可侵染发病,但各分离株致病力差异显著,其中菌落颜色为黄褐色的菌株致病性强。因此,根据菌落颜色、致病性和生物学特性可将这7个分离株划分为3个类群:Ⅰ型为黄褐色强致病类群,但各分离株的产孢量有差异;Ⅱ型为乳白色不产孢的弱致病类群;Ⅲ型为灰褐色易产孢弱致病类群。其余54株分离物均属于Ⅰ型,这些结果说明陕西省苹果树腐烂病菌具有多样性和致病性分化现象。

陕西省小麦白粉菌毒性结构及主栽小麦品种抗性基因的初步分析

为了解陕西省小麦白粉病菌毒性结构以及主栽小麦品种的抗白粉病基因状况,分别从关中和陕南地区的23个市、县采集白粉病标样,利用32个已知抗病基因品种(系)进行苗期毒力频率测定。同时在6个不同生态区对已知抗病基因品种的成株期抗病性进行了监测。结果表明,V1、V2、V3a、V3b、V3c、V3d、V3f、V5、V6、V8、V17、V2+Ta、V4+8、V1+2+19、V"Era"苗期毒力频率均在60%以上,成株期Pm3d、Pm5、Pm"Era"、Pm7、Pm21、Pm4+8在2个生态区表现感病。由此推断,陕西省优势毒性基因谱为V3d、V5、V"Era"、V4+8。已知抗白粉病基因Pm13、Pm2+Mld、Pm4b+Mli、Pm"XBD"成株期在不同生态区均表现抗病,且苗期毒力频率很低,应在小麦抗病育种中加以有效利用。陕西省主栽小麦品种抗病基因初步分析结果表明,武农148、远丰175、远丰139可能分别含有Pm8、Pm21、Pm17等抗病基因,其他6个品种抗病基因尚不明确。

陕西省油菜菌核病调查初报

调查了关中和陕南地区784个油菜田块的3 920个样点的冬季菌核数、早春子囊盘数和春季病株率,发现关中地区田块菌核平均出现率达到52.11%,玉米前茬田块平均每样点菌核数高达4.09个;陕南地区田块菌核平均出现率为43.40%,玉米前茬田块平均每样点菌核数为3.90个,而前茬为水稻的田块均未发现菌核。子囊盘数在前茬为玉米的田块为14.20枚/m2,而前茬为水稻的田内未见子囊盘。病株率调查结果显示,前茬作物种类、油菜品种、地域对发病影响很大,表现为玉米前茬田发病率明显高于水稻前茬;绵油、秦油和蓉油系列品种发病率没有显著性差异,均为感病品种。另外,不同地区之间发病率也存在显著差异。

2001-2005年陕西省小麦条锈菌生理小种变化动态

为掌握小麦条锈菌种群动态,2001-2005年对采自陕西省7市20个县(区)主栽小麦品种和后备小麦品种苗期和成株期的条锈菌标样1 101份进行了鉴定。结果表明,2001-2005年陕西省共监测到已知条锈菌生理小种和致病类型26个,分别为条中22、23、26、27、28、29、31、32号,Hybrid46-4、5、6、7、8,水源11-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14。其中条中31号以前的生理小种已成为次要小种或稀有小种,条中32号出现频率一直居各小种首位,成为绝对的优势小种;Hybrid46类群和水源11类群为绝对的优势小种类群,频率总和维持在90%左右,成为优势种群。从变化趋势看,Hybrid46类群出现频率逐年下降,水源11类群出现频率逐渐上升。

陕西省新育成品种(系)对小麦赤霉病抗性的分析

为了明确陕西省2005-2007年新育成小麦品种及高代品系对赤霉病的抗性,采用单小花接种法对531份小麦品种（系）分年度进行了抗赤霉病鉴定和抗病性分析。结果表明,在这些材料中没有免疫材料;抗病品种（系）仅7份,占1.32%;中抗品种（系）26份,占4.90%;其余498份品种（系）均表现中感-感病,所占频率达93.78%。所有材料发病率均为100%。2005和2006年采用田间人工诱发接种的方法对344份材料的鉴定结果表明,抗病材料37份,占10.76%,发病率为3.3%-20.0%;中抗材料50份,占14.53%,发病率为13.3%-66.7%;中感-感病材料257份,占74.71%,发病率为23.3%-100.0%。由此可见,陕西省新育成小麦品种及高代品系对赤霉病的抗性普遍较差。建议根据各地赤霉病发生程度,选择适度抗性指标,结合现代生物技术,逐步提高新育成品种（系）抗赤霉病水平。

苜蓿黄萎病菌中国菌株生物学特性研究

为了解我国苜蓿黄萎病菌的生物学特性,于2007-2008年间对苜蓿黄萎病菌进行了分离、鉴定及生物学特性研究。采用常规组织分离法从新疆伊犁地区新源县苜蓿黄萎病标样中分离到一种真菌(VA001),依据Koch′s法则,并结合形态学、培养特性及ITS序列分析,鉴定为黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold)。适合该菌生长的培养基有甜瓜培养基、马铃薯蔗糖培养基、马铃薯培养基,适合产孢的培养基有马铃薯葡萄糖培养基、甜瓜培养基、梅干培养基。在碳源和氮源中,麦芽糖(Maltose)、乳糖(Lactose)、甘露醇(Mannitolum)、赖氨酸(Lysine)、牛肉膏(Beef extract)、氨基乙酸(Aminoacetic acid)、组氨酸(Histidine)有利于病菌的生长;蔗糖(Sugar)、果糖(Fructose)、乳糖(Lactose)、硝酸钠(Sodium nitrate)、丙氨酸(Alanine)有利于病菌的产孢。苜蓿黄萎菌生长和产孢的适宜pH值为7.0-9.5,温度为25℃。

西北旱区枣疯病植原体核糖体蛋白基因的生物信息学分析

枣疯病是枣树上的一种具有毁灭性的植原体病害,几乎分布于国内所有的枣树栽培区,造成了巨大的经济损失。对我国陕西、宁夏、甘肃3省枣疯病样品植原体核糖体蛋白基因进行克隆和测序,获得枣疯病植原体的核糖体基因片段为1 196bp,包含部分rps19,rpl22和rps3三个基因,其中rpl22和rps3大小分别354bp和753bp,分别编码118和251个氨基酸,且这两个基因为非重叠基因。序列同源性比较结果表明:我国陕西、宁夏、甘肃的枣疯病植原体的核糖体蛋白rp基因大小一致,归属于植原体16SrⅤ-B组;该植原体核糖体蛋白基因特性与樱桃致死黄化(CLY5)和桃树黄化印度分离株系(PY-In)植原体相似。首次报道了我国枣疯病核糖体蛋白基因rp基因的序列,把枣疯病植原体归到16SrⅤ-B组,为枣疯病植原体提供了新的分类依据。

陕西省苹果黑星病菌遗传多样性的AFLP分析

【目的】明确陕西省苹果黑星病菌的遗传多样性,为苹果抗病育种和黑星病菌的综合防治提供理论依据。【方法】利用25对AFLP引物,对采自陕西兴平、旬邑的46个苹果黑星病菌菌株进行群体结构和遗传多样性分析。【结果】25对AFLP引物共扩增出421个条带,其中多态性条带326个,占总带数的77.4%;陕西兴平和旬邑苹果黑星病菌AFLP多态位点比率为22.57%～69.83%,平均为47.74%;等位基因观测数为1.23～1.70,平均为1.48;有效等位基因数为1.16～1.46,平均为1.33;Nei氏基因多样性指数为0.09～0.27,平均为0.19;Shannon信息指数为0.14～0.39,平均为0.27;各类群间的Nei氏遗传相似系数为0.8151～0.9487,遗传距离为0.0527～0.2044;总的遗传多样性为0.29,群体内遗传多样性为0.18,群体间遗传多样性为0.11,遗传分化系数为0.38;陕西苹果黑星病菌菌株分为2大类,分离自旬邑嘎啦、兴平嘎啦、旬邑富士的菌株聚为一类,分离自旬邑红星、兴平红星、旬邑秦冠、兴平秦冠的菌株聚为另一类。【结论】陕西苹果黑星病菌菌株的遗传多样性与地理来源没有明显的相关性,而与寄主品种具有一定相关性。

两株白粉寄生孢的生物学特性比较

对L9和L3两个白粉寄生孢菌株的生物学特性研究表明，它们的生长适温为10～30℃，其中最适生长温度分别为25℃和20℃；适宜生长的pH为4～10，其中最适pH均为8。有利于L9菌株菌落生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉、乳糖和牛肉膏；有利于L3菌株菌落生长的碳、氮源分别为葡萄糖、乳糖和蛋白胨；改良查氏培养基有利于两者菌落的生长。

黄淮麦区126个小麦品种(系)抗条锈病基因的分子检测

【目的】鉴定黄淮麦区近年小麦主栽品种和后备品种对当前条锈菌流行小种的抗性水平;了解抗条锈病基因在该区小麦品种中分布状况,为小麦安全生产与品种合理布局提供依据。【方法】以中国小麦条锈菌当前流行小种条中32(CYR32)和水源致病类型14对黄淮麦区126个小麦品种(系)进行苗期抗性鉴定;分别用Yr(91B/1R)、Yr5、Yr10、Yr15和Yr26基因有效的分子标记检测其在参试品种(系)中的分布状况。【结果】在126个供试材料中,对CY32和水源致病类型14均表现免疫或近免疫的品种(系)只有11个,占8.73%;携带Yr9基因的小麦-黑麦1B/1R易位系的频率仍高达41.6%;分子检测表明,14份抗CY32的小麦品种(系)中,6份可能含有Yr5基因,4份可能含有Yr10基因,4份可能含有Yr15基因,3份可能含有Yr26基因;周麦17、0020-332和N19等3份材料未检测到上述Yr基因(分子标记)的存在,其对CYR32的抗性可能是受其它未知基因控制。【结论】黄淮麦区小麦品种(系),特别是主栽品种对当前条锈菌流行小种的抗性水平较低,对新小种具有良好抗性的Yr5、Yr10、Yr15和Yr26基因在小麦品种(系)中的分布频率很低,亟待将这些抗条锈病基因转育至小麦品种中。

“西北-华北-长江中下游”条锈病流行区系当前小麦品种(系)抗条锈病性评价

【目的】西北-华北-长江中下游麦区是中国小麦条锈病最主要的流行区系,准确评价大区间当前小麦品种抗条锈病性水平和抗源使用特点,为整体考量各流行区小麦抗性品种分布的合理性和确定今后的育种方向提供依据。【方法】从该区系13个省(区)征集了501份小麦当前主栽品种和后备品种,在杨凌进行苗期分小种(CYR32和CYR33)和成株期混合小种(CYR23、CYR25、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4、Su11-7)人工诱发接种鉴定,在天水自然发病条件下进行抗条锈病性鉴定。【结果】参鉴小麦品种(系)中,表现为全生育期抗性的品种仅有34份,占参试品种(系)的6.8%,表现成株期抗性的品种为110份,占参试品种的22.0%,表现感病的品种(系)为356份,占供试品种(系)的71.0%;流行区系内不同地区间小麦品种抗条锈性水平存在较大差异;结合育种系谱分析,具有全生育期抗病性的品种(系)的有效抗源类型较丰富,但在品种(系)中的分布不均衡,主要集中在92R系(携带Yr26)、贵农系以及少数携带Yr24的CIMMYT抗源种质。【结论】当前中国小麦主产区小麦品种抗条锈性整体水平仍较低,必须加强病害预测预报和防治,以避免大区流行;小麦品种主要有效抗源较单一,且在不同流行区同时使用。

小麦品种中梁22抗条锈病基因的遗传分析和分子作图

对中梁22/铭贤169杂交F2群体苗期抗条锈病鉴定及中国春单体系抗病基因的染色体定位发现,中梁22携带1个显性(暂命名YrZhong22)和1个隐性抗病基因,前者位于5B染色体。由中梁22×铭贤169的F2群体构建抗病、感病池,用SSR标记结合集群分离分析法(BSA),建立了与YrZhong22连锁的4个微卫星标记Xwmc289、Xwmc810、Xgdm116和Xbarc232,并将YrZhong22定位于小麦5BL染色体。YrZhong22与相邻微卫星位点Xwmc810和Xgdm116的遗传距离分别是2.7cM和4.4cM。系谱分析及分子标记分析表明,YrZhong22可能是一个来自中间偃麦草的新抗条锈病基因。

不同药剂和农业措施对油菜菌核病的防治研究

通过在陕西关中和陕南不同生态区试验研究,结果表明,多菌灵、戊唑醇、速克灵均可作为防治油菜菌核病的有效药剂,但以速克灵效果最好,防效达到80%以上;其施药期为油菜初花-盛花期,施药次数以2次为宜,间隔7-10 d茎叶面喷施。进行药剂防治的同时,在油菜终花初期采取摘除主茎1-1.2 m以下＂三叶＂措施能进一步提高对菌核病的防病效果,尤其在陕南地区春季多雨、田间湿度大情况下防病效果明显,防病保产效果达到15%以上。采取＂宽窄行＂栽培与常规＂等行距＂栽培模式相比,对菌核病预防效果不明显,但丰产效果显著。推广栽培抗病品种,并结合药剂等关键防治技术对菌核病能起到更好的控制效果。

植物内生放线菌防治西葫芦白粉病的初步研究

以西葫芦白粉病为对象,通过温室盆栽试验和叶盘筛选试验,从50个内生放线菌菌株中筛选出2个防病效果较好的菌株,叶盘筛选试验发现菌株GKSHJA和PR1-8的无菌滤液原液在接种病菌的同时使用防治效果最佳,分别达到60.98%和63.22%。温室人工接种白粉病菌的盆栽试验发现,GKSHJA无菌滤液原液在接种前、接种后24h喷雾,相对防治效果分别达55.22%和16.44%;菌株PR1-8的相对防效分别为51.94%和24.39%,且GKSHJA和PR1-8无菌滤液的5倍稀释液在接种病菌的同时使用也有一定的防病效果,其病情指数分别比对照降低了27.81%和30.19%。在自然感病的田间试验中,菌株GKSHJA和PR1-8无菌滤液的5倍稀释液对西葫芦白粉病的相对防效分别达到56.33%和69.88%。这些结果表明,菌株GKSHJA和PR1-8作为防治瓜类白粉病的生防菌株,具有开发应用潜力和前景。

6株野生植物内生放线菌防病促生作用的初步研究

为了寻找具有内生习性的植病生防放线菌,从采自秦岭的14种野生植物中分离得到29株内生放线菌,对其进行了皿内拮抗试验、发酵液抑菌试验和温室防病促生试验。结果发现,有6株菌表现出显著的抑菌活性,其中菌株SF1对粉红聚端孢、SF4对苹果炭疽菌、SF20对灰葡萄孢均有较强的抑制作用;菌株SG2的代谢产物具有很高的抑菌活性,其发酵滤液对茄链格孢的抑菌圈直径达到35 mm;菌株SG2对温室番茄早疫病的防治效果达到89.72%,菌株SF4对黄瓜白粉病的温室防效达到89.61%,菌株SF20对番茄和黄瓜具有明显的促生作用。可见,从野生植物中分离具有内生习性和抑菌作用的放线菌,直接用于生物防治是可行的。

植物内生放线菌活性物质防治猕猴桃溃疡病

以供试内生放线菌发酵液的皿内抑菌活性为指标,得到对猕猴桃细菌性溃疡病菌有抑制活性的菌株76株,其中35株的发酵液对猕猴桃溃疡菌的抑菌圈直径≥20mm,5株对猕猴桃溃疡病菌均具有显著的抑制活性。其中gCLA4菌株发酵液抑菌谱最广,不仅对4种靶标细菌具有抑制活性,还对10种植物病原真菌有较强的抑制活性。通过发酵液制备及大孔吸附树脂D101处理得到gCLA4菌粗提活性物质。田间防治结果表明,gCLA4菌株粗提活性物质100倍稀释液对猕猴桃溃疡病28d的相对防效达64.9%,明显优于化学药剂施那宁。

陕西太白尾矿区根瘤菌多样性及抗性菌株筛选

以研究陕西太白金矿尾矿区根瘤菌的资源多样性和重金属、苯酚抗逆性菌株的筛选为目的,选取分离自尾矿废弃地及太白河边的8种豆科植物的108株根瘤菌及42株参比菌株,进行了生长温度范围,唯一碳源、氮源利用,生长初始pH,耐盐性,重金属和苯酚的抗性等151项表型性状分析。结果表明,供试根瘤菌的表型特性存在明显差异,在85%的相似水平上供试菌株聚成5个类群,其中类群I有26株菌,主要分离自天蓝苜蓿(Medicago lu-pulina);类群Ⅱ有12株菌,其寄主各不同;类群Ⅲ有3株菌,寄主均为金翼黄芪(Astragalus chrysopterus);类群Ⅳ有40株菌,主要分离自金翼黄芪;类群Ⅴ有4株菌,寄主均为截叶铁扫帚(Lespedeza cuneata)。类群Ⅳ与已知种R.mongolense聚在一起,其这4个类群未与参比菌株聚在一起,可能是新的表观群,其分类地位需进一步确定。一些菌株表现了较强的抗重金属和苯酚毒性的能力,其中1株菌能耐受0.15 mmol/L的Hg2+,4株菌能耐受0.4mmol/L的Cu2+,3株菌能耐受1.6 mmol/L的Zn2+,5株菌能耐受900 mg/L的苯酚。