15个化杀杂交小麦亲本配合力和杂种优势群的初步研究

为给小麦杂种优势利用提供依据,以15份普通小麦为材料,采用NCⅡ设计组配44个组合,研究了8个农艺性状的杂种优势和配合力。结果表明,杂种F1的杂种优势是普遍存在的,各性状大都表现出正向优势;周麦22、西农889、西农375和罗大穗316的产量性状一般配合力相对效应较高,参与组配的强优势组合较多。在44个杂交组合中,(D177×罗大穗316)、(周麦22×花培87-8)、(周98165×西农375)、(周麦22×西农889)、(周麦22×200(1)穗2)、(周麦22×郑育麦9987)、(周麦22×07常-261)、(周98165×西农889)、(周麦22×罗大穗316)、(周麦22×西农375)为强优势组合。利用普通小麦亲本8个性状的一般配合力将15份亲本划分为5类,直接以普通小麦亲本8个性状的表现值亦可将15份普通小麦划分为5类。

杂交小麦强优势组合抗白粉病基因的定向导入与改良研究初报

为创制杂交小麦白粉病抗性定向改良育种新体系,以白粉病抗源材料N95175、N9134为抗病种质,以强优势杂交小麦新品种"西杂一号"和"西杂五号"的亲本为受体,以陕西不同地区小麦白粉病流行混合菌种为菌源,对供试材料亲本、杂种F1代和回交后代材料进行了苗期和成株期抗性鉴定,并利用与抗白粉病基因Pm21共分离的SCAR标记、抗白粉病基因PmAS846紧密连锁的SSR标记作为抗病性定向选择分子标记进行了抗病性鉴定。结果表明,以N95175、N9134为亲本的杂种F1含有Pm21基因或PmAS846基因,苗期和成株期均表现为高抗,与抗病亲本的抗病性表现基本一致,符合杂种优势表现显性假说,其抗病性主要由显性单基因控制。研究同时表明,仅凭借表型鉴定结果盲目性较大,表型鉴定和分子标记鉴定相结合准确率较高。

杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花粉粒差异蛋白质组学研究

采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向凝胶电泳对经杀雄剂SQ-1处理和未处理的小麦(Triticum aestivum)成熟期花粉总蛋白质进行了分离,银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.通过PDQuest 2DE图像软件的分析,在等电点4～7之间可识别350个以上较为清晰的蛋白质点,其中差异表达明显的蛋白质点数为21个.将11个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行了肽质量指纹图谱分析,采用Mascot软件在Swiss-prot数据库查询,鉴定出了7个蛋白质,它们分别是液泡转化酶、动力蛋白轻链TCTEX-1、锰超氧化物歧化酶、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、抗坏血酸过氧化物酶、凝集素蛋白激酶和一种未知功能的蛋白.对已知蛋白的功能进行分析,推测杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育可能与能量代谢失衡、淀粉合成受抑制、活性氧积累、细胞凋亡以及花器官发育调节基因作用失控等有关.

粘类小麦CMS育性基因分布区研究

为更有效地选育小麦不育系的高恢复系,以8个粘类小麦细胞质雄性不育系(Cytoplasmic malesterility,CMS)为测验种,对310份来自国内外不同地区的普通小麦品种及亲本材料对粘类小麦CMS系的育性恢保关系进行调查,并采用聚类分析法研究了粘类小麦CMS育性基因的地区分布。结果表明:(1)高恢复能力的品种在中国春麦区和南方冬麦区的分布比例均超过50%,具有保持性的品种在加拿大分布最多,我国北方冬麦区次之,春麦区分布最少。(2)不同地区品种恢复度存在差异。(3)将48个普通品种聚为3类:第1类品种对粘类CMS的平均恢复度均低于20%,属全不育和高不育类型;第2类品种的平均恢复度在20%～55%范围内,基本属于半不育类型;第3类品种的平均恢复度均大于55%,属高可育和全可育类型。(4)对不育系进行聚类:90-110核背景下,K型和V型聚为一类,Ven型和B型聚为一类;224核型下V型和B型聚为一类,再和K型聚为一类,与Ven型距离最远;相同细胞质背景下,90-110和224两种核型分别在一定水平上被分为2个类别。

杂交小麦F_1与F_2品质组配规律及高分子量谷蛋白亚基组成规律的研究初报

为了探明杂交小麦F1与F2代品质的组配规律及高分子量谷蛋白亚基组成规律,选取不同品质类型的14个亲本材料,以8种设计,按照强筋×强筋、强筋×中筋、强筋×弱筋、中筋×强筋、中筋×中筋、弱筋×强筋、弱筋×中筋、弱筋×弱筋等方式组配不同杂交组合,分别测定其中8种F2代的品质以及亲本、F1代、F2代的高分子量谷蛋白亚基组成,结果表明,以优质和含有优质亚基的品种作母本对杂交小麦F2品质改良有重要作用,同时在亚基中出现了5+10亚基,其对品质有重要的影响。F1代籽粒中出现了高分子量谷蛋白亚基共显现象和不完全表达或缺失现象。经观察发现,缺失的带基本都是父本的亚基带。

粘类小麦雄性不育基因rfv1定向导入的研究

为了研究粘类非1BL/1RS小麦雄性不育基因rfv1定向导入的途径与方法,从而创制粘类非1BL/1RS小麦雄性不育系的新保持系,以非1BL/1RS普通小麦变种莫迦小麦为供体材料,综合农艺性状优良的1BL/1RS易位系(普通小麦品种)西农Fp1为受体材料,采用定向回交置换方法,同时结合根尖染色体镜检和SDS-PAGE检测,将莫迦小麦核基因组中的rfv1不育基因定向导入到西农Fp1的核基因组,完成育性染色体的专一替换,育成既携有来自莫迦小麦核基因组的rfv1不育基因,又具有西农Fp1核背景的粘类非1BL/1RS小麦雄性不育系的新保持系。该方法为杂种优势利用中更好地发挥粘类小麦雄性不育系的实际作用奠定了坚实的技术支撑。

黏类小麦CMS不育基因rfv_1的分子细胞遗传学跟踪鉴定及定向转育研究

为了实现黏类小麦雄性不育基因rfv1的定向转育,创制优良的黏类非1BL/1RS小麦雄性不育新保持系,本研究以1BS上带有不育基因rfv1的非1BL/1RS小麦变种SP4、莫迦小麦为供体材料,以杀雄剂途径培育的小麦强优势组合西杂1号和西杂5号杂交小麦新品种的母本西农Fp1和西农Fp2为受体材料,采用专一核置换回交转育方法,同时结合根尖细胞学镜检、复合引物PCR及SDS-PAGE和A-PAGE技术,进行不育基因rfv1定向转入的鉴定,旨在育成既携带rfv1不育基因,又具有西农Fp1和西农Fp2核遗传背景的黏类非1BL/1RS小麦雄性不育新保持系。结果如下:(1)根尖体细胞随体鉴定和复合引物PCR分析表明,该法不仅能准确鉴定出1BL/1RS纯合易位系,还可鉴定出1BL/1RS.1BL/1BSrfv1易位杂合体,两者结果一致。其中复合引物PCR更适合于回交后代中大量目标植株的筛选,为小麦雄性不育基因rfv1定向转移到1BL/1RS易位系提供了准确的鉴定方法与依据;(2)利用SDS-PAGE技术对供试材料进行高低分子量麦谷蛋白亚基的分析表明,在低分子量谷蛋白D亚基区存在莫迦小麦和SP4的特征带;而SP4的高分子量谷蛋白亚基区的6+8亚基,也可以作为示踪小麦雄性不育基因rfv1定向转移到非1BL/1RS易位系的特征亚基条带;(3)A-PAGE技术对醇溶蛋白的分析表明,在ω-醇溶蛋白区也发现莫迦小麦和SP4不同于西农Fp2的特异蛋白条带,也可作为示踪小麦雄性不育基因rfv1定向转移到非1BL/1RS易位系的特征蛋白条带。本研究成功地将小麦杂种优势利用中的杀雄剂法和三系法相结合,促进了小麦杂种优势利用新技术体系的建立。同时该方法亦可应用于黏类小麦雄性不育恢复基因Rfv1的定向转育,进而可实现小麦由生理型不育向遗传型不育的定向转化,以探索一套杂交小麦强优势组合多途径利用的新方法。

粘类小麦CMS恢复基因Rfv1快速定向转育体系的研究

为了实现粘类小麦雄性不育恢复基因Rfv1的定向转育,创制优良的粘类非1BL/1RS小麦雄性不育新恢复系,以携有粘类小麦雄性不育恢复基因Rfv1的恢复系亲本5253、5383为供体,以西农Mp1、西农Mp2(化杀杂交小麦新品种西杂1号、西杂5号的父本)为受体,采用定向回交转育方法,结合根尖细胞学镜检、复合引物多重PCR等技术,进行了恢复基因Rfv1的定向转育与检测,育成既携有Rfv1恢复基因,又具有西农Mp1、西农Mp2核基因背景的粘类非1BL/1RS小麦雄性不育新恢复系。本研究表明:(1)根尖体细胞随体鉴定和复合引物PCR分析,不仅能准确地鉴定出1BL/1RS纯合易位系,而且可以鉴定1BL/1RS.1BL/1BSRfv1易位杂合体。其中复合引物PCR更适合于回交后代中大量目标种子的筛选;(2)恢复基因转育后代定株与不育系测交,依据测交恢复度可准确确定恢复基因在回交后代的延续,恢复基因定株定向转育与性状选择结合可大大提高转育后代的实际应用效果;(3)本研究提出的粘类小麦雄性不育恢复基因Rfv1定向转育体系,可有效地实现小麦由化控强优势组合向三系强优势组合的定向转化,即生理型不育途径向遗传型不育途径的定向转化,进而建拓一套杂交小麦强优势组合多途径利用新体系。

小麦多子房性状外显率影响因子的初步研究

为了提高杂交小麦的繁制种效益,选用具有不同山羊草细胞质的同质同核、同质异核、异质同核多子房小麦为试验材料,于成熟期调查多子房外显率,并用DPS 7.05专业数据处理软件对调查结果进行方差分析,研究了多子房外显率表达的影响因素。结果表明,具有相同细胞核和细胞质背景的多子房小麦,各小花内第一、二、三粒子粒多子房外显率表达效应无显著差异;异质同核背景下的多子房外显率的表达效应也无显著差异;相同细胞质不同细胞核背景下的多子房外显率的表达效应达到显著水平。因此,欲提高小麦多子房性状表达的外显率,选择合适核型至关重要。

杀雄剂SQ-1诱导谷子雄性不育研究

选取3个不同的谷子品种,以杀雄剂SQ-1为雄性不育诱导剂,采用3种不同杀雄剂浓度,在3个不同发育时期对谷子喷施处理,以喷水为对照。杀雄剂SQ-1在适宜喷施剂量与时期下,供试品种五九爪软谷和香谷能被诱导产生95%～100%的雄性不育率,对黄金谷杀雄效果尚未达到90%。五九爪软谷和香谷的喷药适宜时期分别为七叶期和八叶期,喷施剂量同为4～5kghm-2,以5kghm-2的杀雄效果最佳。

小麦质核互作型雄性不育系及其保持系花药差异蛋白质组学分析

为了能从蛋白质水平揭示小麦细胞质雄性不育的分子遗传机制,采用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术,对小麦质核互作型雄性不育系(S)-1376A及其保持系(A)-1376B在花药发育的单核期、二核期蛋白质进行了差异蛋白质组学研究,经考马斯亮蓝染色,得到了重复性较好的双向电泳图谱.PDQuest软件在分子质量9.0～100.0ku、等电点4～7线性范围内,可识别约610个蛋白质点,对28个差异表达的蛋白质点采用基质辅助激光解吸分离飞行时间质谱进行肽指纹图谱分析,并利用Mascot软件在NCBInr数据库搜索,鉴定出12个差异表达蛋白,其中5个差异表达蛋白可能与雄性不育有关,分别是泛素结合酶E2、甘氨酸富集蛋白、抗坏血酸过氧化物酶、假定半胱氨酸蛋白酶抑制剂及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小链克隆512,它们参与了物质能量代谢、细胞程序化死亡及花发育调控等过程,推测不育系(S)-1376A雄性不育性可能与这些生理生化代谢有关.研究结果为揭示雄性不育机理提供了理论依据.

小麦花药蛋白质组双向电泳技术体系的优化

以小麦单核期花药为材料,比较了两种不同蛋白质提取方法TCA/丙酮法和酚提取法及不同的蛋白质裂解液组成对双向电泳的影响,并在蛋白质上样量和SDS-PAGE胶浓度等方面也进行了探索与优化。结果表明,采用TCA/丙酮提取法比用酚提取法提取的蛋白质所得的2-DE胶图谱上蛋白质点数增加,图谱背景也比较清晰;样品溶解于含有硫脲和TBP的蛋白质裂解液Ⅱ中,可显著提高蛋白质的溶解性,在2-DE图谱上可分辨出554个蛋白质点,比用蛋白质裂解液Ⅰ提取的蛋白多39个点。以TCA-丙酮法提取小麦花药组织中的蛋白,用蛋白质裂解液Ⅱ[7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、2%TBP、65mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质（其中0.1%pH 3-10,0.1%pH4-6）]溶解蛋白,以pH4-7线性17cm的IPG胶条进行双向凝胶电泳,在上样量为800μg,13%SDS-PAGE胶浓度下,蛋白质得到了更好的分离,2-DE图谱上可分辨出631个蛋白点,图谱质量最佳。优化后的双向电泳技术体系,适合于小麦花药全蛋白质的双向电泳分析。

杀雄剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育小花完整叶绿体差异蛋白质的鉴定

为了在蛋白质水平揭示小麦雄性不育的分子遗传机制,以小麦经杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系,以及对应正常可育系所构建的等生理差异系为试材,应用差速离心和蔗糖密度梯度离心,首先分离出供试材料小花的完整叶绿体,制备蛋白样品后采用固相IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对完整叶绿体蛋白质进行了分离、银染,得到了重复性较好的双向电泳图谱.PDQuest2DE软件分析识别出约150个较为清晰的蛋白质点,采用MALDI-TOF鉴定出的6个差异表达蛋白质分别是:PAP-fibrillin、ATRABB1A、底物同源结构域蛋白/RhoGAP结构域蛋白、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、R2R3-MYB转录因子及1个假定蛋白质.生物信息学功能分析暗示,这些蛋白直接参与了花药内激素调节、蛋白质转运、蛋白质互作、活性氧积累及花药的发育,表明SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理可能就与这些生理代谢过程的变异直接相关.

小麦雄性不育系中TaPDC-E1α及其调节酶基因的表达特征

为进一步研究杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育的机制,采用电子克隆的方法分离TaPDC-E1α基因,并利用半定量RT-PCR技术分析该基因及其调节酶基因PDK和PDP的表达特性。结果表明,TaPDC-E1α基因编码388个氨基酸,具有TPP保守结构域,可能存在2个丝氨酸磷酸化位点;与可育系相比,TaPDC-E1α基因在生理型不育系和遗传型不育系中表达下调;PDK基因在生理型不育系中表达下调,而在遗传型不育系中表达上调;PDP基因在可育系及不育系中的表达趋势无明显变化。表明经杀雄剂SQ-1诱导形成的生理型不育系在败育过程中其能量代谢途径更容易受到影响,推测对PDK基因进行调节的上游信号机制在小麦生理型不育系与遗传型不育系中可能不一致。

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制,利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序,获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释,比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱,发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高,在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。

化学杂交剂诱导的小麦生理型雄性不育花药的活性氧代谢

以化学杂交剂SQ-1诱导的生理型小麦雄性不育及其对照植株花药为材料,研究了不同花粉发育时期花药中超氧阴离子(O2.-)生成速率、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量以及主要抗氧化酶活性的变化,以探明小麦花药活性氧代谢和生理型雄性不育的关系。结果表明,在幼穗时期,O2.-生成速率、H2O2和MDA含量、超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均高于相应对照,而过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性则低于或显著低于对照;在单核早期以及花粉败育主要发生期(单核后期和二核初期),O2.-生成速率、H2O2和MDA含量极显著高于对照,而SOD、POD、CAT和APX酶活性却极显著低于对照;在败育后的花药中,O2.-生成速率和H2O2含量与对照之间差异幅度缩小,但MDA含量依然加大,同期的几种抗氧化酶活性依然极显著低于对照。在败育的关键期,品种‘西农1376’处理株花药的活性氧升高幅度比‘西农2611’处理株较大,抗氧化酶活性降低幅度也较大,且‘西农1376’处理株的相对雄性不育率也较高。可见,化学杂交剂SQ-1能诱导小麦花药中O2.-和H2O2大量积累以及SOD、POD、CAT和APX活性的极显著降低,引起花粉关键败育期花药活性氧代谢严重失衡和严重膜脂过氧化,导致大量花粉母细胞发育受到严重抑制,最终造成小麦生理型雄性不育。

小麦生理型雄性不育花药中能量相关基因的表达

为揭示小麦(Triticum aestivumL.)生理型雄性不育机理,以化学杂交剂SQ-1为诱导剂,构建了普通小麦西农1376不育和可育生理系,用RT-PCR技术分析了3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和NFUDP4基因在不同发育时期的不育和可育花药中的表达差异。结果表明,与同期对照相比,GAPDH和NFUDP4基因在不育花药单核期到三核期均下调表达,其中在大量花粉粒败育的单核期,GAPDH下调表达尤为显著。因此,小麦生理型雄性不育花药败育过程中,一方面由于GAPDH基因表达受抑制,使糖酵解受阻导致能量供应不足;另一方面,NFUDP4基因下调表达,可能引起线粒体某一Fe-S族蛋白装配需要的分子骨架减少而使其数量不足,从而可能引起Fe-S族蛋白参与的生化反应减弱,如呼吸链电子传递受阻引起能量供应不足,与小麦生理型雄性不育具有一定关系。

顺乌头酸酶基因在杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花药中的表达分析

采用RT-PCR技术,克隆了小麦胞质顺乌头酸酶基因(cACO)部分cDNA序列.该cDNA序列长1368bp,编码456个氨基酸,GenBank登录号为GU475062.半定量RT-PCR结果表明,在生理型不育和可育花药发育的单核早期至三核期,cACO基因的表达水平均表现为先升后降;在生理型不育花药发育的单核晚期cACO基因表达水平与同期可育花药相比显著升高,到二核期和三核期明显降低,ACO酶活性变化表现出相同趋势.这反映出在小麦生理型不育系中,cACO基因在花药败育关键期异常表达可能影响了花药发育过程中正常的能量供应和物质代谢,导致花粉发育能量不足和所需物质匮乏,从而导致了非遗传型花药败育现象.

几类同核异质雄性不育小麦线粒体DNA的RAPD标记多态性

为了明确不同细胞质来源的小麦不育系mtDNA的差异,对具有相同核背景而细胞质分别来源于偏凸山羊草(Ae.ventricosa)、易变山羊草(Ae.Variabilis)、提莫菲维小麦(T.timopheevi)的3种小麦细胞质雄性不育系,采用50条随机引物对其细胞质线粒体DNA(mtDNA)进行了RAPD多态性分析,筛选出3条特异性引物,其中引物S22在ms(Ae.ventricosa)-90-110中扩增出分子量约为1 500bp的特异带,引物OPAA16在ms(T.timopheevi)-90-110中扩增出分子量约为1 200bp的特异带,引物OPA05在ms(Ae.vari-abilis)-90-110中扩增出分子量约为670bp的特异条带。分析表明,3类不同细胞质的小麦不育系在线粒体DNA上表现出稳定的差异,为进一步在分子基础上鉴别这3类不育胞质源不育系奠定了基础。

杂交小麦西杂5号及其亲本mtDNAs的RAPD分析

为了探讨小麦杂种优势组配与父母本线粒体DNA(mtDNA)差异的关系,以及小麦化学杀雄剂诱导小麦雄性不育与mtDNA的关系,利用RAPD技术对强优势杂交小麦新品种西杂5号及其母本FP2和父本MP2的mtDNA进行了比较研究。结果表明,在50条引物中,有20条引物在父本和母本之间,6条引物在杂种和母本之间分别扩增出差异带。杂种和母本之间mtDNA的差异,说明线粒体传给子代时,mtDNA受到新的核基因型背景的影响,或者受化学杀雄剂作用发生了一定的变异;父本和母本间mtDNA存在较大的差异,说明它们的线粒体基因组成不同,这很有可能用作杂交小麦强优势组合选配的预测指标而加以深入研究或利用。