基于金磁微粒标记技术的可目视化蛋白质芯片检测方法的建立

目的应用金磁微粒标记蛋白质技术,建立可目视化蛋白质芯片检测体系,比较金磁微粒和胶体金标记蛋白质技术应用于蛋白质芯片检测效果的优劣。方法将人IgG点制于环氧基修饰的玻片上,分别与金磁微粒和胶体金标记的羊抗人IgG温育,银染显色,肉眼观察并用普通扫描仪记录结果。结果基于金磁微粒的蛋白质芯片人IgG最佳点样浓度为0.2mg/ml,37℃温育2h,银染10～15min,检测结果信噪比高;基于胶体金的蛋白质芯片人IgG最佳点样浓度为0.1mg/ml,37℃温育1h,银染15～20min,检测结果信噪比高。结论金磁微粒标记蛋白质技术应用于蛋白质芯片的检测,具有和胶体金一致的可目视化检测效果,且其标记技术简单,标记的蛋白质可定量。

凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用

建立了凝集素芯片技术检测糖蛋白的方法,对实验条件进行了优化,应用凝集素芯片初步检测分析了Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成.将凝集素ConA、GNA固定于环氧化修饰的玻片表面,用Cy3标记标准糖蛋白RNaseB,利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法.摸索出最佳封闭剂是含1%BSA的磷酸缓冲液,最佳孵育时间及温度为3h和室温,最佳孵育缓冲液为含1%BSA和0.05%Tween-20的磷酸缓冲液,并用甘露糖抑制实验验证了凝集素芯片结合的特异性.用包含10种凝集素的芯片,成功解析了标准糖蛋白RNaseB、Fetuin的糖链构成,证实了凝集素芯片检测糖蛋白糖链的可行性.最后用凝集素芯片初步检测分析了Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成,发现Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白可能有多价Sia或GlcNAc、terminalα-1,3 mannose、GalNAc、Galβ-1,4GlcNAc这些糖链结构的存在.蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它在微生物感染、细胞分化、肿瘤转移、细胞癌变等生命活动中起着重要作用,因此近年来蛋白质的糖基化研究受到广泛的重视,但由于缺乏一种简便、快速、高通量的检测手段,蛋白质糖基化修饰的研究发展缓慢.凝集素芯片技术的出现实现了对糖蛋白的快速、准确、高通量的检测分析.

非还原脲变性蛋白溶菌酶稀释复性过程中集聚现象的研究

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效凝胶排阻色谱法,研究了非还原脲变性蛋白溶菌酶在稀释复性过程中的集聚现象.实验发现,在整个稀释复性过程中,没有蛋白溶菌酶集聚体沉淀产生.当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度小于4.0mg/mL时,复性过程中不会形成蛋白溶菌酶分子集聚体;当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度介于4.0～8.0mg/mL时,复性过程中会形成由非共价相互作用所引起的蛋白溶菌酶二分子和三分子集聚体;而当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度大于8.0mg/mL时,复性过程中除了会形成二分子和三分子蛋白溶菌酶集聚体外,还会形成四分子蛋白溶菌酶集聚体.在此基础上,结合文献,对非还原脲变性蛋白溶菌酶的稀释复性过程进行了描述.

人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的应用研究

目的:采用人乳头瘤病毒(HPV)液态芯片对HPV感染患者进行基因分型,为早期诊断与治疗HPV感染和宫颈癌提供依据。方法:采用13种HPV基因分型液态芯片,对100例尖锐湿疣及100例宫颈糜烂患者进行HPV基因分型检测。以反向斑点印迹法作为对照检测。结果:100例尖锐湿疣患者中感染HPV单一型占78%(其中HPV6占42%,HPV11占36%);混合型占20%,其中高危型占6.3%。宫颈糜烂患者临床标本PCR阳性率为55%;对50例PCR阳性的患者进行HPV分型,其中9例可检出型别,高危型占67%。两种方法检测有较高的一致性,但液态芯片方法更灵敏。结论:HPV基因分型液态芯片可以快速、精确和高通量地对HPV感染标本进行HPV分型检测。

功能化磁性微粒的合成及表面巯基的测定

目的研究以3-巯丙基三乙氧基硅烷作为Fe3O4磁性粒子表面修饰剂,合成微米级磁响应性好且巯基含量较高的功能化磁性微粒,并对磁性微粒粒径以及表面巯基含量进行表征。方法激光粒度散射仪对功能化磁性微粒进行粒径分析,傅立叶变换红外光谱(FTIR)对巯基修饰前、后磁性微粒表面的功能基团进行表征,E llman方法对功能化磁性微粒表面巯基含量进行定量测定。结果氮气保护,乙醇与水体积比1∶1作为溶剂,500μL浓氨水为催化剂,加入300μL硅烷化试剂与170 mg磁性Fe3O4粒子充分反应,合成了平均粒径约为5μm的巯基化磁性微粒,所建立E llman方法对功能化磁性微粒表面巯基含量的测定结果为357μmol/g。结论功能化磁性微粒表面巯基的修饰及定量测定,为其在生物及医学领域的应用奠定了基础。

酸酶序解法制备高吸水性玉米多孔淀粉的研究

以玉米淀粉为原料,采用酸酶序解法制备了高吸水性玉米多孔淀粉。通过单因素实验和正交实验研究了酸酶序解过程中各主要因素对多孔淀粉吸水性能的影响。确定最佳酸处理条件为:盐酸质量浓度3.0%、淀粉乳质量浓度40%、处理时间70 min、处理温度50℃;最佳酶解条件为:复合酶加量为理论水解量的40%、酶解时间18 h、酶解温度40℃、pH值4.0。用该酸酶序解法制备的玉米多孔淀粉的吸水率为156.98%,比传统的单用复合酶解法提高约20%。

应用Real Time PCR方法检测病毒灭活去除效率

目的建立检测血液制品中病毒灭活去除效率的模型。方法应用SYBR GREEN I实时荧光定量PCR验证不同方法的病毒去除效率,并用病毒感染力实验验证不同方法的病毒灭活效率。结果以PCR产物为外参的实时荧光定量PCR正确反映出实际核酸含量和检出拷贝数的线性关系,以重组质粒为外参的实时荧光定量PCR实验证明巴氏灭毒法的病毒去除效率低于金磁颗粒法。病毒感染力实验证明巴氏灭毒法灭活效率略高于金磁颗粒法。结论实时荧光定量PCR法联合病毒感染力试验可以有效评价不同方法在病毒灭活和病毒去除方面的差异。

应用液态悬浮芯片技术建立HPV基因分型方法

目的应用液态悬浮芯片技术,建立一种新的人乳头瘤病毒(HPV)基因分型方法。方法应用通用引物从HPV基因组中扩增出目的片断,与13型荧光微球偶联探针杂交,通过LuminexTM100检测HPV的型别。结果检测十三型标准株质粒,对单一标准品和混合标准品均可准确分型。结论初步建立了高通量、快速、可靠、适用于临床的人乳头瘤病毒分型基因诊断方法。

秦巴山区汉族人群DXS8027基因座的多态性分布研究

为了解秦巴山区汉族人群的DXS8027微卫星序列的遗传多态性,获得该基因位点的群体遗传学数据。采集秦巴山区汉族人群无关个体静脉血样550份,EDTA抗凝,用酚—氯仿法抽提基因组DNA,PCR扩增目的片段,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,0.1%硝酸银(AgNO3)染色分型。结果,在秦巴山区人群中共检出9种不同的DXS8027等位基因,整体人群的基因频率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),并具有较高的杂合度(Het=0.7968)。虽然男性和女性间等位基因分布不一致(χ2=30.242,P<0.01),但在不同地域同性别人群间、不同地域的全体研究人群间无差异(χ2=4.703,P>0.05;χ2=14.952,P>0.05;χ2=15.2,P>0.05);比较秦巴山区和欧洲人群的DXS8027等位基因,发现两者之间存在极显著差异(χ2=37.572,P<0.01)。这些结果为进一步研究该位点在不同人群中的分布提供了基础数据。

猪血红蛋白及戊二醛聚合猪血红蛋白氧载体的研究

目的阐明猪血红蛋白的主要理化特性,并了解戊二醛聚合反应对猪血红蛋白主要性能的影响。方法猪血经多步纯化获取高纯度猪血红蛋白,以戊二醛为交联剂制备聚合猪血红蛋白样品。鉴定猪血红蛋白的纯度、聚合体分子量分布、携氧性能及自氧化等指标。结果猪血红蛋白在生理pH条件下的P50为23.6 mmHg,Hill系数为2.86。聚合猪血红蛋白为分子量大小不均一的混合体,聚合体P50和Hill系数均减小,自氧化趋势增大。结论猪血红蛋白具有较高氧亲和力,与人血红蛋白相似,明显高于牛血红蛋白。猪血红蛋白的丰富来源、特殊的氧亲和力和较好的化学稳定性等特点使其可成为一种血红蛋白类氧载体产品制备的有用材料。

载阿霉素磁性壳聚糖微球靶向治疗大鼠移植性肝癌

目的合成磁性壳聚糖微球并将其应用于Walker-256大鼠移植性肝癌模型治疗研究。方法将荷瘤大鼠分3组:生理盐水组、阿霉素组及载阿霉素磁性壳聚糖微球组,门静脉给药;对各组动物进行生存率分析以及给药前后白细胞和血小板计数分析。结果载药磁性壳聚糖加磁场治疗组较生理盐水和阿霉素治疗组生存期明显延长(P<0.05),并可以部分抑制阿霉素对骨髓干细胞的损伤作用。结论靶向治疗明显减轻了阿霉素的骨髓抑制毒性,显著延长了荷瘤大鼠的寿命。

体外研究人细胞色素P450 3A4等位基因多态性对药物代谢和药物相互作用的影响

目的体外研究药物对人细胞色素P4503A4(CYP3A4)(野生型,WT)及其4个突变等位基因重组酶CYP3A4*3(M445T)、CYP3A4*4(I118V)、CYP3A4*17(F189S)和CYP3A4*18(L293P)的抑制程度。方法采用荧光高通量法和HPLC法分别测定WT及其4个突变等位基因重组酶催化荧光底物——二甲基荧光素(DBF)脱烷基化和探针底物——硝苯地平氧化反应时的酶动力学参数;且通过测定大扶康、万络、西乐葆、酮康唑、地尔硫卓和维拉帕米的半数抑制浓度(IC50)值,确定6种药物对酶的抑制程度。结果除F189S外,其余4种重组酶均能催化DBF和硝苯地平反应生成相应的产物。各突变等位基因重组酶催化DBF反应的Km值(亲和力)与WT相当,M445T和L293P的内在清除率分别是WT的3.1和3.8倍(P<0.05),I118V是WT的1.3倍(P=0.1010)。各重组酶催化硝苯地平氧化反应的Km值均比WT小,I118V和L293P的内在清除率分别是WT的0.7和2.6倍(P<0.05),M445T与WT相当(P=0.7676)。6种药物对各重组酶的抑制程度强弱均为:酮康唑>地尔硫卓>维拉帕米>大扶康>西乐葆>万络;药物对各重组酶的IC50值大小为:WT<L293P<M445T<I118V。结论等位基因突变导致了酶动力学特征的改变和药物对酶抑制程度的不同,为进一步研究临床联合用药安全性奠定基础。

微型流动注射化学发光仪测定蔬菜中残留的有机磷农药

目的利用便携式流动注射化学发光仪和紫外降解装置,检测蔬菜中残留的有机磷农药。方法过硫酸钾在紫外光的催化下能将有机磷降解为无机磷,无机磷在酸性条件下可以和钒酸盐、钼酸盐反应生成具有氧化性的磷钼钒杂多酸,可直接氧化鲁米诺产生强而稳定的化学发光信号;根据发光强度与磷的浓度在一定范围内呈线性关系,从而实现有机磷农药的定量测定。结果测定磷的检出限为1.0×10^-10g/mL,线性范围为1.0×10^-9-3.0×10^-6g/mL,对浓度为2.0×10^-7g/mL的磷平行测定11次,相对标准偏差为2.1%;当青菜中有机磷农药的添加浓度为1.00 mg/kg和2.00 mg/kg时,方法回收率在89.5%-113.5%之间。结论此方法简便快捷、准确可靠,实现了检测仪器的自动化和微型化,为市售蔬菜中有机磷农药残留的现场检测奠定了基础。

基因芯片对胃癌和食管癌基因表达谱的对比研究

目的对比研究胃癌和食管癌的基因表达谱,筛选各自特异性基因。方法利用基因芯片技术对两种上消化道常见肿瘤胃癌和食管癌的基因表达谱进行分析。结果筛选出在胃癌中差异表达的基因34个,和21个在食管癌中发生差异表达的基因,最后发现在两种肿瘤组织中都发生显著变化的基因有4个。另外,对这些肿瘤相关基因的表达水平进行聚类分析,可以很清楚地将两种肿瘤组织及正常组织区分开来。结论利用基因芯片技术可以高通量地筛选出肿瘤组织差异表达基因,通过少量特异性基因的表达水平,可以用来区分不同的肿瘤组织,对将来的基因诊断和基因治疗有一定的参考价值。

新型定性-定量测定血红蛋白氧载体的检测系统Ⅲ.建立抗人源性氧载体类兴奋剂检测系统的初探

目的构建一种高通量蛋白芯片检测人血清中血红蛋白氧载体类兴奋剂的方法。方法用自制SEC微柱快速地将人血清中血红蛋白聚合体(氧载体)和血红蛋白单体(另外加入的内标)分离,逐滴收集洗脱液作为探针,点样结合在蛋白质基片上,与其相对应的荧光标记的多克隆抗体进行杂交,扫描芯片荧光强度检测人血红蛋白氧载体。结果自制SEC微柱能够将戊二醛聚合的人血红蛋白聚合体和单体有效分离,在蛋白芯片的检测中能较好地检测出人血清中1.5%的聚合体人血红蛋白氧载体。结论以SEC技术和蛋白芯片相结合是一种高通量、灵敏、重现性好的检测人血清中的以人血红蛋白为基质氧载体类兴奋剂新方法。

人细胞色素P4502D64个单核苷酸突变株活性及其与药物相互作用的体外研究

目的探讨单核苷酸替换对人细胞色素P450CYP2D6酶活性及其与药物相互作用的影响。方法体外构建CYP2D6野生株(WT)和G169R、P34S、E410K、V7M等4个单核苷酸突变株的表达载体并在酿酒酵母中诱导表达,裂解并提取各酶的蛋白微粒体,用蛋白质印迹法验证其表达,再分别测定各酶代谢底物丁夫洛尔和3-[2-(N,N二乙基-N-甲铵)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)的米氏常数(Km)和最大酶促反应速度(Vmax)。以AMMC为底物对CYP2D6WT和V7M、G169R进行高通量药物抑制实验,所选药物包括已知的2D6抑制剂(奎尼丁、舍曲林)、底物(氯丙嗪、氟西汀、阿米替林)和既非抑制剂又非底物的化合物(酮康唑、曲格列酮),求得不同药物对不同酶的半数抑制浓度(IC50)。结果蛋白质印迹法检测显示各酶均表达良好。CYP2D6WT代谢丁呋洛尔和AMMC的Km值分别为19.22、2.06μmol·L-1,Vmax值分别为154.53、21.60pmol·min-1·mg-1,Vmax/Km值分别为8.04、11.49μl·min-1·mg-1。与CYP2D6WT比较,V7M代谢2种底物的Vmax值均要高得多(P<0.05),G169R和E410K均稍低,而P34S都要低很多(P<0.05);各突变株的Km值也发生了或多或少的改变。药物对CYP2D6WT和V7M和G169R的抑制程度排序均为奎尼丁>氯丙嗪>氟西汀>阿米替林>舍曲林>酮康唑/曲格列酮;药物对V7M和G169R的IC50值与CYP2D6WT的IC50值比值,奎尼丁分别为0.88和0.80,氯丙嗪0.54和0.80,氟西汀0.65和1.02,阿米替林0.85和0.71,舍曲林0.43和0.74。结论CYP2D6部分单核苷酸突变株的酶动力学特征与野生株有明显差异,单核苷酸替换可导致酶对药物抑制的敏感性发生变化。

HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测

目的探讨HCV非结构蛋白质5A(NS5A)基因全长和高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。方法以含HCV全基因组的质粒pBRtm/HCV-3011(1型)为模板,采用PCR方法扩增出NS5A全长基因(以下用NS5AL代替)和高免疫源区基因(以下用NS5AS代替),与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pETNS5AL和pET-NS5AS,分别转化E.coliRosetta(DE3)pLysS和BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白质印迹法检测其表达,镍螯合(Ni2+-NTA)琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和NS5AS蛋白,最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性并对其检测灵敏度进行比较。结果SDS-PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明,重组NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达;纯化的重组NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0.146和0.426mg/ml,纯度均>96%;ELISA检测结果表明,重组NS5AL和NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性,且重组NS5AL蛋白的检测灵敏度明显高于NS5AS。结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白,均具有较高的免疫活性。

唾液酸水平对癌症诊断与治疗的作用及其检测方法

唾液酸化有助于肿瘤细胞逃逸,在肿瘤细胞的增殖、转移、肿瘤血管新生等方面发挥重要作用。与正常组织相比,肿瘤组织中经常可以观察到高唾液酸化的肿瘤细胞,血清中的总唾液酸或糖脂结合唾液酸的水平在多种癌症中显著升高,因此,唾液酸水平对癌症的早期诊断有极高的潜在应用价值。对癌症患者体内唾液酸水平变化的可能机制、唾液酸作为潜在生物标志物对癌症诊断及分期的作用、唾液酸在癌症治疗中的作用、血清和血浆中唾液酸水平的检测方法进行了综述,并对唾液酸诊断和治疗癌症的发展前景进行了展望。

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。

从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白

为了从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白,建立了通过超滤、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶排阻色谱三步法制备高纯度猪血红蛋白的方法,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效凝胶排阻色谱和反相高效液相色谱方法,对纯化后的猪血红蛋白进行了鉴定。经三步分离纯化后,猪血红蛋白的纯度大于99%,含量为1.328g/L。