生物制剂工艺特异性残留宿主蛋白ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立基因重组生物制剂中工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法 以大肠埃希菌表达胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide,GLP)的生产与纯化工艺为特定工艺模型,采用同一工艺用于空载大肠埃希菌(不表达重组蛋白的正常大肠埃希菌)残留蛋白的截取。将获得的残留蛋白作为免疫原分别免疫1只雌性新西兰白兔和6只雌性昆明小鼠,以兔免疫血清纯化IgG抗体为包被抗体,鼠免疫血清为第二夹心抗体,抗鼠IgG-HRP为酶标二抗,建立工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA方法。对建立的方法进行特异性、准确性、精密性验证,并确定方法的检测限。同时采用建立的方法和市售大肠埃希菌宿主蛋白残留检测试剂盒对纯化的GLP制剂进行残留蛋白定量测定。结果 对已知浓度的工艺特异性残留蛋白进行系列梯度稀释后,建立的ELISA方法检测的灵敏度可达338 pg/mL;该方法检测CHO和酵母细胞裂解蛋白无交叉反应,检测低、中、高3个浓度样品的回收率均在80%~120%范围内,检测低、中、高浓度空载大肠埃希菌截留液标准品的试验内和试验间CV均<15%。针对GLP制剂中的残留蛋白,与建立的方法检出的GLP制剂中残留蛋白总量相比,约有62%的残留蛋白未被市售非工艺特异性ELISA试剂盒检出,这些残留蛋白应为本工艺特异的残留蛋白。结论 建立的双抗体夹心ELISA法检测工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白灵敏度高,特异性强,准确性和精密性良好,可满足残留蛋白在生物制剂中低于0.01%~0.1%标准的检测要求。