小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定

为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。

C基因沉默的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株反向遗传学系统的建立

为建立小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)反向遗传学体系,本研究以PPRV Nigeria75/1疫苗株基因组序列为基础,PCR分7个片段扩增病毒基因组,运用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)在3’端引入锤头状核酶(Hammerhead ribozyme,HamRz)、5’端引入丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis D virus ribozyme,HdvRz)和T7终止子,构建PPRV全长cDNA感染性克隆质粒pBluescript SK-PPRV,进一步构建C基因沉默的病毒全长cDNA感染性克隆染质粒pBluescript SK-PPRVΔC。pBluescript SK-PPRVΔC、pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L共转染BSR T7/5细胞,48 hpt后收集细胞反复冻融上清液感染山羊子宫内膜上皮细胞(GEECs),盲传3代,拯救重组病毒命名为rPPRVΔC。重组病毒感染GEECs细胞中RT-PCR扩增出病毒N、P和部分L基因(L2)片段,Western blot检测到N蛋白表达、C蛋白未表达,IFA也检测到N蛋白表达,成功建立了PPRV Nigeria75/1株反向遗传学体系。研究结果为PPRV新型标记疫苗的研制及C蛋白致病机理研究奠定了基础。