黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18 T载体中。以此片段构建了pPIC9K phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G4 18抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 395 8 3u mL发酵液 (PP N14 2 2 )和 14 890 8 3u mL发酵液 (PP N14 4 4 )的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (4 2 2u mL)的 341 13倍和 35 2 86倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2 5～ 3 0和 5 0～ 5 5时酶活性最高 ,且在pH4 5～ 6 5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为5 5℃。