低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响

目的:明确低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响。方法:体外培养A375细胞,CoCl 2构建细胞内低氧模型。细胞分为空白对照组,CoCl 2组,SB-431542(Nodal抑制剂)组和CoCl 2+SB-431542组。通过Western Blot技术检测Nodal、类激活素激酶4/7(ALK4/7)、与恶性肿瘤进展相关的上皮钙黏附蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP 2)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平。结果:CoCl 2组细胞内Nodal及ALK7蛋白浓度,高于其他组(P<0.05)。各处理组均没有检测到ALK4蛋白;CoCl 2组细胞中Vimentin和MMP2蛋白的浓度高于其他组(P<0.05);各处理组E-cadherin蛋白水平差异不具统计学意义。结论:低氧环境可诱导A375细胞中Nodal和细胞迁移相关蛋白MMP2和Vimentin的高表达。

人LDH-B基因克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人乳酸脱氢酶B(LDH-B)基因并构建其真核表达载体。方法提取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的总RNA,逆转录生成c DNA,以c DNA为模板,采用PCR扩增获得LDH-B基因编码区序列片段,限制性核酸内切酶Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切LDH-B基因片段及p UC19质粒,连接反应构建p UC19-LDH-B克隆载体,并将其转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选挑取白色菌落,酶切验证后测序鉴定。将序列正确的LDH-B基因亚克隆到pc DNA3.1(-)载体上,构建LDH-B真核表达载体pc DNA3.1(-)-LDH-B。结果PCR扩增后可见约1.0 kb的特异性条带,与预期的LDH-B片段长度相符合;Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切p UC19-LDH-B后可见约2.6 kb和1.0 kb的条带,分别与p UC19和LDH-B的片段长度相符合,LDH-B测序结果与DNA序列数据库(Genebank)中的参考序列相一致;Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pc DNA3.1(-)-LDH-B后可见约5.5 kb和1.0 kb的条带,分别与pc DNA3.1(-)和LDH-B的片段长度相符合。结论成功克隆了人LDH-B基因,并构建了其真核表达载体,为进一步探究LDH-B的生物学功能奠定了基础。

低氧环境对黑素瘤细胞增殖及LDH表达的影响

目的探讨低氧对黑素瘤细胞增殖、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)同工酶亚基(LDH-A、LDH-*/B)蛋白表达及LDH同工酶谱的影响。方法使用氯化钴(CoCl_2)构建黑素瘤A375细胞株低氧模型。用MTT法观察CoCl_2诱导低氧下对A375细胞的增殖,探索CoCl_2诱导A375细胞增殖的适宜浓度和时间。Western blot技术检测低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)蛋白表达水平以验证低氧模型成功;Western blot技术检测低氧对黑素瘤细胞LDH-A、LDH-B蛋白表达的影响;琼脂糖凝胶电泳技术检测低氧下LDH同工酶谱活性的变化情况。结果MTT法显示CoCl_2诱导的低氧使MM细胞的增殖能力在一定范围内随着CoCl_2作用浓度的递增和作用时间的延长而逐渐下降。其中,CoCl_2的作用浓度50、100、150、200、250μmol/L时细胞增殖无明显抑制(P>0.05)。CoCl_2对A375细胞作用的最佳浓度、时间分别是150μmol、48h。Western blot技术结果显示CoCl_2可上调A375细胞中HIF-1α、LDH-A蛋白的表达,下调LDH-B蛋白表达(P<0.05),并呈现出一定的浓度及时间范围依赖性关系;琼脂糖凝胶电泳技术检测结果显示随着低氧浓度的递增,LDH同工酶谱中LDH3、LDH4和LDH5活性逐渐增高,LDH1和LDH2下降(P<0.05)。结论适量CoCl_2可成功诱导A375细胞低氧;低氧具有促肿瘤细胞增殖效应,其可能的机制与HIF-1α、LDH-A过表达,LDH-B表达下调及LDH同工酶谱变化有关。