肝X受体β在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的探讨肝X受体β(liver X receptorβ,LXRβ)在皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)中的表达及其意义。方法采用PCR array、Western blot检测LXRs在角质形成细胞(keratinocyte,KC)和皮肤鳞状细胞癌A431细胞系中的表达,并采用免疫组化Envision法检测LXRβ在52例日光性角化病(actinic keratosis,AK)、40例鲍温病(Bowen’s disease,BD)、60例cSCC中的表达,分析LXRβ表达与患者临床参数之间的关系。结果与KC比较,A431细胞中LXRα、LXRβ的mRNA和蛋白水平均升高,以LXRβ升高尤为显著。免疫组化染色结果发现LXRβ在AK、BD、cSCC中表达逐渐升高,以cSCC升高最明显,其表达与肿瘤分化程度、瘤体大小、浸润深度相关(P<0.05),与年龄、性别、发病部位无关(P>0.05)。结论 LXRβ在鳞状细胞癌细胞和组织中表达均升高,且与肿瘤的增殖、分化相关。

细胞色素P450 2E1在酒精性肝损伤中的作用及研究进展

酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由各种肝脏细胞和损伤因子（包括氧化应激、亚硝化应激、凋亡诱导因子、内毒素和细胞因子等）相互作用导致的病理生理学病征。肝脏是药物、毒素、合成化合物及氧化产物进行解毒的重要目标器官[1]。

外周动脉反应性充血指数在冠心病患者血管内皮功能评价中的临床价值

目的对比观察冠心病患者外周动脉反应性充血指数(reactive hyperemia index,RHI)和循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)水平,探讨RHI在冠心病患者血管内皮功能评价中的应用价值,为冠心病病情评估、调脂治疗评价、预后评估提供临床手段。方法选取2015年9-12月在第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所住院患者195例,其中男性115例,女性80例;平均年龄61岁,中位年龄60岁。根据冠状动脉造影结果分为冠心病组(129例)及对照组(66例)。冠心病组进一步按照心脏外科与介入治疗狭窄冠脉协同研究积分法(SYNTAX积分)分为低积分组、中积分组和高积分组。采用流式细胞术检测外周血中的EPCs,并使用外周血管内皮张力计Endo-PAT2000检测受试人群动脉RHI,比较RHI和EPCs评价冠心病危险因素的特异度和灵敏度。结果与对照组比较,冠心病组外周血中EPCs数量显著减少,RHI显著降低(P<0.05),外周血EPCs水平与动脉RHI呈显著正相关趋势(r=0.269,P<0.05)。各冠心病亚组中,中、高积分组较低积分组EPCs水平与RHI显著降低(P<0.05)。糖尿病、高血压病和吸烟可影响RHI和循环EPCs水平(P<0.05),糖尿病是影响RHI的主效应因素。结论 RHI因其操作便利、无创,可直观反映血管内皮功能以及可靠的灵敏度和准确性,在评价冠心病患者血管内皮功能方面较循环EPCs更有优势。

MRPS5对膀胱癌细胞增殖能力及干性特征的影响

目的探讨线粒体核糖体蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)对人膀胱癌细胞的增殖能力及其中干细胞干性特征的影响。方法 Western blot检测人膀胱癌及癌旁正常组织MRPS5的表达;构建靶向干扰MRPS5的慢病毒载体,感染膀胱癌细胞株T24,以干扰Scramble序列作为对照,Western blot检测MRPS5干扰效率;细胞活力实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期;细胞成球实验观察成球能力;Western blot检测肿瘤干性转录因子Nanog,Oct4,c-Myc和Sox2的表达;小鼠皮下移植瘤实验观察T24体内成瘤能力。结果 MRPS5在膀胱癌组织中的表达高于癌旁正常组织;慢病毒干扰载体PLKO.1-sh MRPS5有效,且干扰MRPS5表达后T24细胞增殖能力下降(P<0.05),周期阻滞于S期,干性因子表达均下调,成球率无变化(P>0.05)但成球直径明显减小;同时小鼠体内成瘤体积减小[(0.784±0.278)vs(0.500±0.245)cm3,P<0.05],瘤质量减轻[(0.862±0.372)vs(0.412±0.248)g,P<0.05]。结论 MRPS5在膀胱癌中较高表达,且干扰MRPS5表达能抑制T24增殖并抑制T24中的干细胞生物学特征。

髓样分化蛋白-2模拟肽抑制巨噬细胞吞噬革兰阴性菌

目的探讨髓样分化蛋白-2模拟肽(MD-2 mimetic peptide,MDMP)对巨噬细胞吞噬革兰阴性菌的影响及所致炎症因子分泌的抑制效应。方法采用PCR从p EGFP-C3质粒中扩增出表达EGFP的基因片段,通过基因重组构建原核表达载体p ET-32a(+)-EGFP,经测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)PLys S中筛选出稳定表达的重组菌p ET-32a(+)-EGFP-BL21(DE3)PLys S(简称为EGFPBL21)。以IPTG诱导重组质粒表达后,通过免疫荧光和流式细胞术检测RAW264.7细胞对EGFP-BL21的吞噬能力以验证EGFP-BL21的构建情况。进一步检测RAW264.7细胞对经不同浓度MDMP(1.0、10、100μg/m L)预处理后的EGFP-BL21的吞噬效应;采用ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的分泌水平。结果筛选获得稳定表达EGFP的重组大肠杆菌BL21(DE3)PLys S,重组菌经巨噬细胞RAW264.7吞噬后流式和激光共聚焦检测结果显示细胞内出现明显的绿色荧光。MDMP预处理后,流式检测结果显示RAW264.7细胞对EGFP-BL21的吞噬能力受到明显抑制,预处理组(10、100μg/m L)的吞噬系数(PI)显著低于经血清调理的阳性对照组(P<0.01),且细胞培养上清TNF-α和IL-6的分泌水平显著降低(P<0.01)。结论 MDMP预处理可明显抑制RAW264.7细胞对革兰阴性菌的吞噬作用,并降低该过程中炎症因子TNF-α和IL-6的分泌。

索拉非尼诱导的耐药性肝癌细胞的生物学特征分析

目的探讨索拉非尼对肝癌细胞Huh-7、PLC/PRF/5以及原代细胞T1115、T1224的影响及索拉非尼耐受型细胞的生物学特征。方法通过长时间10μmol/L索拉非尼处理建立索拉非尼耐药细胞模型,采用MTS法和克隆形成实验测定不同浓度索拉非尼处理对不同细胞的增殖影响。采用Western blot检测细胞内p-AKT、p-STAT3以及干性相关基因(Nanog、Sox2、Oct4)的表达情况;采用RTPCR检测多药耐药基因ABCC1的表达,并通过划痕实验和Transwell实验检测索拉非尼耐药细胞和亲本对照细胞的迁移能力的变化情况。结果索拉非尼对肝癌细胞系和原代细胞的增殖抑制作用随着索拉非尼浓度的提高而增强,并且索拉非尼能够有效地下调p-AKT、p-STAT3的表达。成功建立了PLC/PRF/5索拉非尼耐药细胞株模型,并发现耐药细胞相对于亲本细胞的增殖能力显著下降,但迁移能力显著增强。进一步实验结果表明耐药细胞株高表达ABCC1、Nanog、Sox2和Oct4。结论索拉非尼能够有效地抑制肝癌细胞的生长,其耐受型细胞具有更强的迁移能力,并且具有干细胞样特征。

肺腺癌肿瘤相关巨噬细胞的免疫组织化学双标染色方法优化

目的通过对现有的免疫组织化学双重标记方法(双标)的改进,探索一种稳定且易于辨认的显色方法,便于在普通光学显微镜下观察肺腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。方法改进的免疫组织化学双标染色分别使用二抗链接的碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶作为底物显色酶,底物分别选用固红(AP-Red)和二氨基联苯胺(DAB),在显微镜下次序控制双标显色,观察肺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。结果免疫组织化学双重标记中第一标记AP-Red的红色与第二标记DAB的棕黄色反差大,背景低,易于分辨。两种颜色标记的同一部位呈现砖红色,易于表示双标部位。统计显示在肺腺癌组织标本中,以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主,约占80%。结论改进后的显色系统建立了简便、可靠的免疫组织化学双重标记新方法。标记结果可以清晰稳定显示肿瘤相关巨噬细胞在肺腺癌组织中分布情况,便于进一步研究其在肺癌发生、发展中的作用。

敲低肌切蛋白可抑制胃肠道间质瘤细胞的增殖能力

目的探讨肌切蛋白（scinderin,SCIN）对胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）细胞增殖能力的影响。方法用shRNA慢病毒干扰技术将SCIN在GIST细胞中稳定敲低,并通过Western blot和qRT-PCR检测敲低效率。通过CCK-8实验检测伊马替尼IC50和SCIN对GIST细胞增殖能力的影响,通过平板克隆形成实验检测SCIN对GIST细胞克隆形成能力的影响,通过裸鼠皮下成瘤实验检测SCIN对移植瘤生长的影响。实验按照对GIST细胞进行的不同处理分组：WT组（野生型组,未进行转染）,Mock组（阴性对照组,转染阴性对照序列）,sh SCIN 1组（转染SCIN干扰序列1）,sh SCIN 2组（转染SCIN干扰序列2）。结果 sh SCIN 1组和sh SCIN 2组GIST细胞在增殖能力上明显低于Mock组,增殖能力在第2~7天均有明显差异（n=4,P〈0.05）。移植瘤实验中sh SCIN 1组较Mock组的移植瘤质量显著降低：sh SCIN 1组vs Mock组=（0.175 0±0.045 6）g vs（0.334 1±0.016 5）g（n=4,P〈0.01）。平板克隆形成实验显示sh SCIN 1组克隆形成数显著少于Mock组,分别为59.67±5.68和123.33±2.52（n=3,P〈0.01）。在使用0.57μmol/L的伊马替尼处理WT组细胞1、3、5 d后,SCIN的表达随处理时间而降低。结论敲低SCIN可以抑制GIST细胞在体外和体内环境中的增殖能力,伊马替尼可以抑制GIST细胞中SCIN的表达,SCIN可能成为GIST的治疗靶点。

迷走神经递质P物质对人类肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其分子机制

目的探讨迷走神经递质P物质对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其相关分子机制。方法实时荧光定量PCR及琼脂糖凝胶电泳检测并分析两种人肝癌细胞株Hep G2和SMMC-7721中神经肽-1(NK-1)受体表达;Cell Titer Blue检测不同浓度P物质(0、100、250、500 nmol/L)在不同时间点(0、24、48、72、96、120 h)对肝癌细胞增殖能力的影响;肝癌细胞均经不同浓度的(0 nmol/L,对照组;100 nmol/L,实验组)P物质处理48 h,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭功能,Western blot检测细胞中上皮-间质转化蛋白质标志表达变化,实时荧光定量PCR及Western blot检测NK-1受体表达变化。结果 Hep G2和SMMC-7721两种人肝癌细胞中均有NK-1受体表达;不同浓度P物质(0、100、250、500 nmol/L)在96 h内不影响两种细胞的增殖能力(P>0.05),而在120 h 250 nmol/L和500 nmol/L P物质可抑制两种细胞增殖(P<0.05);100 nmol/L P物质明显促进两种细胞迁移和侵袭能力(P<0.05);与对照组相比,实验组细胞NK-1受体表达明显上调(P<0.05),同时,细胞中上皮-间质转化蛋白质标志E-Cadherin表达下调,N-Cadherin和Slug表达上调(P<0.05)。结论迷走神经递质P物质与人肝癌细胞中表达的NK-1受体相互作用并使其表达上调,促进细胞发生上皮-间质转化,进而提高其侵袭转移能力。

miR-125b对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用

目的观察miR-125b对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)成球、克隆形成、增殖、凋亡、迁移的作用,探讨miR-125b对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用。方法获取肝癌干细胞;包装表达miR-125b的慢病毒并感染肝癌干细胞;光镜计数法检测miR-125b对肝癌干细胞成球率及克隆形成率的影响;CCK-8法检测miR-125b对肝癌干细胞增殖能力的影响;DAPI染色观察miR-125b对肝癌干细胞凋亡的影响;Transwell实验检测miR-125b对肝癌干细胞迁移能力的影响。结果与对照组比较,miR-125b显著降低LCSCs的成球率(对照组27.7%,实验组0.0%,P<0.01)以及抑制其克隆形成能力(对照组29%,实验组6%,P<0.01);同时miR-125b可促进LCSCs的凋亡,抑制LCSCs的迁移能力(P<0.01)。结论 miR-125b对LCSCs的成球能力、克隆形成能力具有明显的抑制作用,表明miR-125b对LCSCs的自我更新能力具有负向调控作用。miR-125b也能抑制LCSCs的迁移,对LCSCs的凋亡具有促进作用。

表达靶向癌胚抗原的嵌合受体的慢病毒载体构建及初步应用

目的构建表达靶向癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的慢病毒载体LV-EF1α-CEA-2A-GFP-WPRE,研究该载体感染T淋巴细胞后嵌合抗原受体的表达以及对CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤作用。方法利用常规分子克隆技术从含靶向CEA的单链化抗体的载体上得到抗CEA抗体的编码序列,通过测序鉴定,采用酶切将基因片段插入慢病毒载体中。慢病毒载体感染T淋巴细胞后,通过非变性非还原Western blot、流式细胞术检测CEACAR在T淋巴细胞中的表达,体外杀伤实验检测对CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤效果。结果测序结果显示CEA-CAR的序列正确,酶切结果显示慢病毒载体LV-EF1α-CEA-2A-GFP-WPRE构建正确;感染T淋巴细胞后CEA-CAR阳性表达率为62.8%;可有效杀伤CEA阳性肿瘤细胞系(P<0.01)。结论成功构建了表达靶向CEA的嵌合抗原受体LV-EF1α-CEA-2A-GFP-WPRE的慢病毒载体,该嵌合抗原受体可在T细胞中正确表达,并有效杀伤CEA阳性肿瘤细胞。

免疫组化双重标记联合特殊染色技术应用于胶质瘤血管新生的分析

胶质瘤是好发于成人的原发性中枢神经系统肿瘤,约占恶性脑肿瘤的81%[1]。血管新生化是胶质瘤,尤其是胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的突出组织病理学特征,且与其侵袭性和临床不良预后密切相关[2]。因此,探寻胶质瘤中特殊的促血管新生因子,对于研发阻断肿瘤源性血管发生的精准治疗策略,改善这类血管化肿瘤的临床疗效,显得尤为重要。本实验联合应用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)双重标记和过碘酸雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)特殊染色技术,发现胶质瘤细胞内生性的一种生长因子——神经胶质成熟因子-β(glia maturation factor-β,GMF-β)的表达与肿瘤血管新生的相关性。

利用Crispr/Cas9构建POMP基因组原位荧光报告系统及其应用

目的利用Crispr/Cas9系统建立蛋白酶体成熟蛋白(proteasome maturation protein,POMP)基因组原位荧光报告系统。方法构建POMP-2A-mCherry-T载体并转染HEK293(human embryonic kdiney 293 cell)细胞;流式细胞仪分选获取m Cherry阴阳性细胞;实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)检测mCherry阴阳性细胞中POMP基因转录水平表达差异;Western blot检测mCherry阴阳性细胞中POMP蛋白表达差异以及Huh7细胞中JNK1/JNK2磷酸化水平;蛋白酶体活性试剂盒检测mCherry阴阳性细胞中蛋白酶体活性差异。结果 mCherry阳性细胞POMP蛋白表达水平比mCherry阴性细胞高1.3倍(P<0.01),但其基因转录水平差异并不显著(P>0.05);同时mCherry阴性细胞中泛素化水平比mCherry阳性细胞高1.2倍(P<0.01);另外mCherry阳性细胞中蛋白酶体活性也显著高于阴性细胞(P<0.01);低表达POMP的Huh7细胞中,JNK1和JNK2的磷酸化水平分别升高1.5倍和1.4倍(P<0.01)。结论成功构建POMP荧光报告系统;将该系统用于Huh7细胞,发现POMP可改变JNK1、JNK2磷酸化水平,其可能通过JNK信号通路来影响细胞的增殖以及凋亡。