重组人肠三叶因子减轻烧伤后肠源性高代谢的实验研究

目的探讨重组人肠三叶因子(rhITF)对烧伤后肠源性高代谢的作用及期机制。方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,将72只BALB/c小鼠随机分为正常对照组(C组,8只)、烧伤对照组(B组,每个时相点8只)和rhITF治疗组(ITF组,每个时相点8只)。观察伤前及烧伤后1、3、5、7d小鼠静息能量代谢率(REE)的变化,同时检测伤后血浆内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。结果两组烧伤小鼠的REE、TNFα、LPS、IL-1和IL-6水平均明显高于烧伤前水平(P<0.05),两组比较,ITF组小鼠REE明显低于B组,平均降幅达25%左右。与之对应,血浆LPS、TNF-α、IL-1和IL-6含量也明显低于B组(P<0.05)。结论 rhITF能减轻烧伤后肠道受损程度,降低烧伤小鼠血中炎症介质水平,从而减轻烧伤后肠源性高代谢。

抗LPS-IgY防治烧伤小鼠肠源性内毒素血症的实验研究

目的实验研究抗LPS-IgY对烧伤肠源性内毒素血症的作用。方法标准LPS免疫鸡,采用改良水溶法(WD)从蛋黄中提取特异性抗内毒素IgY。将纯系昆明种小鼠制成30%体表面积(TBSA)Ⅲ°烧伤合并内毒素血症的动物模型,喂服抗LPS-IgY并定期检测血中LPS、二胺氧化酶(DAO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等相关指标。结果喂服抗LPS-IgY后,能明显降低烧伤小鼠的死亡率;明显降低血浆中LPS、DAO和TNF-α的含量;回肠黏膜的损伤程度明显减轻。结论抗LPS-IgY有效拮抗LPS,减少其移位入血,减轻回肠黏膜的损害,对烧伤小鼠肠源性内毒素血症疗效较好。

高效耐用抗菌织物敷料在烧伤创面的临床应用研究

目的了解高效耐用抗菌织物敷料(有效成分为载银磷酸锆)对烧伤后Ⅱ度创面的治疗效果及安全性。方法选择符合入选标准的72例烧伤后Ⅱ度创面患者为受试对象,磺胺嘧啶银作为对照组,观察其创面用高效耐用抗菌织物敷料及磺胺嘧啶银覆盖后治疗、控制伤口感染方面的疗效和安全性。结果高效耐用抗菌织物实验组比对照组创面用药后愈合时间明显提前,平均提前3.39d,两组之间差异有统计学意义(P<0.01)。实验组用药后6d及12d的细菌累计清除率分别为83.87%、96.77%,较对照组明显提高。高效耐用抗菌织物对血常规和肝、肾功能均无明显影响,未见局部致敏和全身症状。结论高效耐用抗菌敷料能有效促进烧伤后Ⅱ度创面的愈合,抑制创面细菌生长。

Rho激酶对严重烧伤大鼠血清诱导的肠黏膜上皮细胞调控机制的研究

目的：观察烧伤血清刺激下肠黏膜上皮细胞通透性的变化及Rho激酶信号转导通路所起的作用。方法：常规培养肠黏膜上皮CaCO-2细胞,分为正常对照组、烧伤血清组和烧伤血清6 h＋Y27632组,以FITC-albumin荧光强度检测法检测人肠黏膜上皮细胞在未烧伤、1、2、6、12、24 h时相点通透性变化指标;采用Western blot法检测人肠黏膜上皮细胞中肌球蛋白轻链（MLC）、磷酸化MLC（p-MLC）和Rho激酶蛋白水平在6个时相点的变化及烧伤血清6 h＋Y27632组总MLC、p-MLC及Rho激酶蛋白水平表达。结果：严重烧伤后人肠黏膜上皮细胞通透性明显增加,并呈时相依赖性变化,6-12 h达到最高;p-MLC以及Rho激酶蛋白表达均明显增加。上述蛋白表达的增强可在加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632后取消。结论：烧伤大鼠血清能诱导肠黏膜上皮细胞内Rho激酶激活、p-MLC表达增加及肠黏膜通透性增加,抑制Rho激酶活性能逆转这一作用。

不同营养支持途径给予谷氨酰胺对烧伤大鼠肠黏膜屏障功能的影响

目的观察不同营养支持途径给予谷氨酰胺(G ln)对严重烧伤所致肠黏膜屏障功能损害的影响并探讨其机制。方法采用30%总体表面积Ⅲ度烧伤大鼠模型,160只W istar大鼠按随机数字表法分成正常对照(C)组、烧伤对照(B)组、G ln静脉营养组〔采用肠外营养(PN)+G ln〕和G ln肠道营养组〔采用肠内营养(EN)+G ln〕。各组烧伤大鼠采用等氮、等热量的营养支持,EN+G ln组给予1.0 g.kg-1.-d 1G ln;PN+G ln组给予等量谷氨酰胺双肽;B组使用等量酪氨酸。观察烧伤后1、3、5、7和10 d肠黏膜屏障功能的变化及不同营养支持途径给予G ln对其的影响。结果烧伤后肠黏膜损伤指数、通透性及血浆二胺氧化酶(DAO)活性均明显高于C组(P均<0.01),而肠黏膜血流量、肠黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度及肠上皮细胞增殖指数则明显降低(P<0.05或P<0.01)。与B组比较,PN+G ln组和EN+G ln组对上述指标的改变均有一定的逆转作用,与PN+G ln组比较,EN+G ln组的疗效更优。结论经肠道补充G ln更有利于减轻烧伤后肠黏膜受损程度,促进肠黏膜修复。

早期肠道营养对烧伤病人肠道通透性的影响

目的:观察早期肠道营养对严重烧伤病人肠道通透性的影响。方法:19例临床烧伤病人随机分为早期肠道营养组(EN组)和肠外营养组(PN组),分别测定伤后1、4、8、14d血浆内毒素及肠道通透性(L/M)的改变。结果:血浆内毒素在伤后1d后大多数时相点EN组均显著低于PN组(P<0.01),L/M值在伤后4、8dEN组显著低于PN组。结论:早期肠道营养降低肠道通透性,减少内毒素入血,较好地维护了肠黏膜屏障功能,早期肠道营养优于静脉营养。

去甲肾上腺素对严重烧伤大鼠脑水肿的影响

目的观察去甲肾上腺素(norep inephrine,NE)对严重烧伤24 h大鼠脑水肿的影响。方法健康W istar大鼠48只,完全随机分为正常对照组,高、中、低剂量NE组各1组,烧伤组1组,烧伤前腹腔注入高、中、低剂量NE组各1组,共分为8组,每组6只,采用40%TBSAⅢ度烫伤大鼠模型,通过组织病理学观察、血脑屏障通透性观察、脑含水量测量方法,观察脑组织水肿情况。结果病理观察显示烧伤和烧伤应激时脑组织水肿明显,血脑屏障通透性增高,较正常对照组,差异明显,尤以烧伤应激时更加严重。结论NE诱导了严重烧伤24 h大鼠脑水肿,故认为烧伤后机体的应激反应是促进脑水肿形成的一个重要因素。

重症监护病房康复治疗缩短重度烧伤患者ICU住院时间

目的了解烧伤重症监护病房开展康复治疗对重度烧伤患者ICU住院时间、治疗费用的影响。方法回顾性调查2011年1月—2014年12月入住重症监护病房的重度烧伤患者,分析其临床基础资料及ICU住院时间、治疗费用情况。结果康复治疗早期介入下,重度烧伤患者ICU住院时间有逐年减少趋势,尤其在强化站立行走训练后,ICU住院时间显著缩短。ICU患者的康复治疗费用仅占ICU总治疗费用的3%左右。结论 ICU内开展重症烧伤患者康复治疗安全可行,可显著缩短患者的ICU住院时间,而医疗费用并未大幅度增加,值得在临床中推广。

富组蛋白1促皮肤创伤愈合的细胞学研究

目的了解富组蛋白1(histatin1,Hst1)对人表皮细胞(human adult skin keratinocytos,HaCaT)、人成纤维细胞株增殖和迁移功能的影响。方法细胞增殖实验:(1)将HaCaT细胞、人成纤维细胞均分为空白对照组(1640/DMEM+1%新生牛血清)、Ⅰ组(100μg/ml Hst1)、Ⅱ组(30μg/ml Hst1)、Ⅲ组(3μg/ml Hst1),比较两种细胞的增殖数量;(2)细胞划痕实验:将两种细胞分为空白对照组(1640+1%新生牛血清)、A组(30μg/ml Hst1)、B组[10ng/ml人重组表皮生长因子(recombinant human epidermalgrowth factor,rhEGF)]、C组(30μg/ml Hst1+10ng/ml rhEGF)、D组(15μg/ml Hst1+5ng/ml rhEGF)、E组(15μg/ml Hst1+10ng/ml rhEGF),比较两种细胞体外创面愈合速度。结果 (1)3～100μg/ml的Hst1能够促进HaCaT增殖,72h时Ⅰ组细胞数高于空白对照组、Ⅱ组及Ⅲ组(P<0.01);3～100μg/ml的Hst1能够促进人成纤维细胞增殖,24h时Ⅰ、Ⅱ组细胞数高于其余各组(P<0.01);(2)30μg/ml Hst1能促进HaCaT细胞迁移,16h时A组划痕愈合率高于空白对照组(P<0.01),C、D组高于A组(P<0.05);30μg/ml Hst1能促进人成纤维细胞划痕创面愈合,与rhEGF联合应用时划痕愈合率高于单独用药。结论 Hst1能够促进HaCaT细胞和人成纤维细胞增殖和迁移,与rhEGF联合应用时对其促进体外创伤愈合具有协同作用。

不同途径给予重组人肠三叶因子对烧伤后小鼠肠黏膜屏障功能的影响

目的探讨重组人小肠三叶因子(rhITF)对烧伤后肠黏膜屏障功能的影响。方法建立30%体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,将104只BALB/c小鼠随机分为正常对照组(C组,n=8)、烧伤对照组(B组,n=32)、肠三叶因子灌胃给药组(IG组,n=32)和rhITF皮下注射组(SC组,n=32)。观察伤前及烧伤后1、3、5、7d小鼠肠黏膜屏障功能的变化及不同途径给予rhITF对其的影响。结果烧伤后肠黏膜损伤指数、通透性、血浆二胺氧化酶(DAO)活性明显高于C组,而肠上皮细胞增殖指数和肠黏膜厚度则显著降低。与B组比较,IG组和SC组小鼠的损伤指数、通透性和DAO活性明显降低(P<0.05),黏膜厚度显著增加(P<0.05)。与SC组比较,IG组的疗效更明显(P<0.05)。结论 rhITF能有效减轻烧伤后肠道损伤,维护肠黏膜屏障功能,通过胃肠途径给予肠三叶因子的疗效更佳。

微管损伤与缺氧心肌细胞线粒体损害的关系研究

目的探讨心肌细胞在缺氧条件下微管损伤与线粒体损害的关系。方法常规方法分离培养W istar乳鼠心肌细胞,分为正常对照组、缺氧组及缺氧微管解聚组,分别于缺氧30 m in、1 h对3组进行缺氧处理,并对缺氧微管解聚组进行特异性微管解聚剂秋水仙素解聚微管后采用流式细胞仪定量检测α-微管蛋白荧光强度变化,激光共聚焦显微镜检测α-微管蛋白及线粒体形态、分布及荧光强度变化。结果与正常对照组比较,缺氧组α-微管蛋白免疫荧光强度明显减弱(P<0.01);微管断裂,分布紊乱,线粒体分布亦出现紊乱,规律性基本丧失。与缺氧组比较,缺氧并微管解聚组微管断裂、分布紊乱、荧光强度减弱明显(P<0.01);线粒体分布弥散,完全失去规律性,基质变淡显著,荧光染色强度亦明显降低(P<0.01)。结论心肌细胞缺氧早期(30 m in)即出现微管损伤,说明微管损伤可能是导致心肌细胞线粒体损害的因素。

hTERT基因转染显著延长人骨髓间充质干细胞增殖能力的实验研究

目的构建含有端粒酶逆转录酶(human telom erase reverse transcriptase,hTERT)基因的逆转录病毒,感染人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),观察外源性hTERT基因在hMSCs中的表达及其对hMSCs端粒酶活性和细胞增殖能力的影响。方法构建pLXSN-hTERT质粒,BamHⅠ酶切和测序鉴定,转染PT67包装细胞,G418抗性筛选获得产病毒阳性细胞克隆。用产病毒细胞珠和hMSCs共培养的方法转染hMSCs,G418抗性筛选。以未转染hM-SCs作为对照,用TRAPEZE方法检测hTERT基因转染hMSCs的端粒酶活性,用流式细胞仪检测细胞周期,并观察转染hMSCs的生长情况。结果成功构建了hTERT基因重组pLXSN-hTERT质粒,建立了产病毒pLXSN-hTER-PT67细胞株。获得了hTERT-hMSCs细胞群,与未转染的hMSCs相比,hTERT-hMSCs细胞群端粒酶活性明显增强,hTERT蛋白阳性表达细胞百分率提高,细胞的生命周期显著延长,细胞传代至46代,形态无明显改变,生长良好。结论逆转录病毒载体介导的hTERT基因转染可增强hMSCs的端粒酶活性,提高hMSCs的增殖能力。

机械牵张加重模拟缺血缺氧心肌细胞损伤的研究

目的 验证机械牵张加重模拟缺血缺氧对心肌细胞的损伤效应。方法 利用所建立的心肌细胞体外牵张模型 ,模拟施加缺血缺氧因素 ,观察心肌细胞形态、培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)含量及碘化丙啶 (PI)染色阳性细胞比例的变化。结果 10 %牵张后 ,心肌细胞形态完整 ,LDH及PI染色阳性细胞比例无明显变化。模拟缺血缺氧后形态明显破坏 ,LDH及PI染色阳性细胞比例显著增加。牵张复合模拟缺血缺氧后 ,细胞形态破坏加剧 ,LDH含量急剧上升 ,PI染色阳性细胞比例进一步显著增加 (P <0 .0 1)。结论 机械牵张加剧了模拟缺血缺氧对心肌细胞的损伤效应 ,提示严重烧伤早期过多过快补液导致心脏前负荷的迅速增加对心肌组织产生牵拉可能会加剧业已存在的心肌细胞损伤 ,从而进一步促进了心肌损害的发生。

β4整合素结合蛋白调控成纤维细胞胞外基质生成的实验研究

目的探讨β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)对成纤维细胞胞外基质生成的调控作用。方法分别构建、包装能在哺乳动物细胞中促进和抑制ITGB4BP表达的腺病毒表达载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和慢病毒表达载体Lentivirus-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BP-RNAi,经筛选鉴定有效后,分别感染人正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕(HTS)成纤维细胞,利用ELISA检测细胞培养上清内基质金属蛋白酶(MMP-9)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)的表达情况。结果正常皮肤成纤维细胞内IT-GB4BP高表达后,引起MMP-9、TGF-β1和collagenⅠ表达降低;反之HTS成纤维细胞内ITGB4BP表达抑制后,MMP-9、TGF-β1和collagenⅠ表达增高。结论ITGB7BP对MMP-9、TGF-β1和collagenⅠ表达具有重要调节功能。提示ITGB4BP可能具有抗纤维化的重要功能,为下一步深入探讨HTS的形成机制提供了重要依据。

二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法低温冻存脐血来源不成熟树突状细胞的实验研究

目的:联合使用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch,HES)作为冷冻保护剂并使用非程控降温冷冻技术,研究脐血来源的不成熟树突状细胞低温冻存前后所表现的生物特性,为不成熟树突状细胞的临床应用提供保存方法。方法:GM-CSF(granulocyte-macrophage clonoy-stimulatingfactor)和IL-4(interleukin-4)体外诱导单个核细胞产生不成熟树突状细胞,5%DMSO+6%HES作为保护剂,-80℃冰箱降温,-196℃保存,37～40℃水浴复温,检测方法:台盼蓝拒染回收率,观察细胞形态,鉴定免疫表型,进行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T淋巴细胞增殖情况。结果:冻存不成熟树突状细胞的台盼蓝拒染回收率为88.6%,其细胞形态,免疫表型及刺激未致敏T淋巴细胞的能力与新鲜DC相比无显著性差异。结论:冻存不成熟树突状细胞具有DC的显著特征,其细胞免疫表型和细胞功能实验上仍然保持了不成熟特征,联合使用二甲基亚砜和羟乙基淀粉作为冷冻保护剂对不成熟树突状细胞有良好的保护作用。

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的 体外分离培养骨髓间充质干细胞，并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件。方法 采用直接贴壁法，分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞，应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等，对分离的细胞进行鉴定。以10～40ng／ml的表皮生长因子处理第3代MSCs，观察细胞角蛋白的表达。用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系。结果 原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CDl06、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性，CD34为阴性，符合骨髓间充质干细胞特征。MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7d后，免疫细胞化学结果显示，EGF浓度为30ng／ml和40ng／ml时，细胞角蛋白出现阳性表达；体外诱导14d，呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加，同时integrin131表达量下降。结论 体外培养的MSCs在EGF诱导下，具有分化为表皮细胞的倾向，同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用。

以酵母双杂交系统从成人肝cDNA文库中筛选与研究P311相互作用蛋白的基因序列

目的应用酵母双杂交技术研究与增生性瘢痕相关新候选蛋白P311发生相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交系统,以人P311为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的阳性克隆。以回复性杂交试验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果经过酵母双杂交共获得355个克隆,经过测序和验证,最终确认8个克隆基因。结论获得的8个基因编码的蛋白可能与P311的作用过程有关。

生脉注射液对烧伤后“休克心”防治作用的前瞻性临床研究

目的观察生脉注射液对严重烧伤患者伤后“休克心”的防治作用。方法严格按照临床科研方法设计前瞻性试验方案,将笔者单位符合入选标准的20例严重烧伤患者按完全随机化方法分为给药组和对照组,每组10例。患者入院后均在常规复苏补液的基础上另建1条静脉通道,给药组将生脉注射液40 ml加入50 g／L葡萄糖注射液250 ml中静脉滴注,1次／d,共用3 d;对照组以同样方式静脉滴注未加生脉注射液的50 g／L葡萄糖注射液290 ml。于伤后12 h和1、2、3、4、5 d抽取两组患者股静脉血,检测血清心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的含量。并于滴注前及滴注后1、2、3、5、7 d同法抽血检测两组患者的肝、肾功能及凝血功能指标。结果伤后12 h给药组、对照组患者血清中CK-MB、LDH、cTnI含量均达峰值,分别为(52±20)U／L、(5．9±1．3)μmol·s-1·L-1、(0．274±0．231)μg／L和(91±31)U／L、(8．5±1．8)μmol·s-1·L-1、(0．584±0．192)μg／L,随治疗时间推移呈逐渐下降趋势。但给药组与对照组比较,各项指标在伤后2 d或3 d内下降更显著(P<0．05)。结论患者严重烧伤后早期应用生脉注射液可有效地防治“休克心”损害,对心肌细胞起到一定的保护作用。

颗粒状脱细胞真皮基质的形态学特征及理化性能体外研究

目的研究颗粒状脱细胞真皮基质(particulate acellular dermal matrix,PADM)的体外形态学特征与理化性能。方法收集SD大鼠背部皮肤样本,采用本实验室的脱细胞方法制备片状脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)并分析其内胞核和DNA残留情况。将片状ADM切割成不同规格的PADM,并结合大体观察、组织学分析、电镜技术、激光粒度分析仪和傅里叶变换红外光谱仪检测其外观轮廓、形态学、粒径分布和胶原分子结构。并将其复合人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)体外培养24 h,观察PADM与HUVEC的黏附情况。结果脱细胞方法有效降低了ADM的DNA含量[(1.51±0.37)μg/mgvs(0.30±0.09)μg/mg]。制备的PADM为白色颗粒,外形近似于长方体或立方体,显微镜下HE染色观察显示颗粒内部胶原纤维束结构疏松。扫描电镜显示颗粒断面结构疏松,透射电镜显示胶原原纤维周期性横纹结构和均匀分布的胶原原纤维间隙。激光粒度分析仪检测显示其粒度分布集中,例如,规格为0.2 mm的PADM,其80%(d0.1～d0.9)的粒径分布于233～487μm。FTIR结果显示,PADM分别在1 659、1 549、1 239 cm-1处出现的特征吸收峰,表明其保留了胶原分子的α-helix、β-sheet和β-turn二级结构,且体外HUVEC较易黏附于PADM。结论室温条件下,切割法制备的新型PADM形态规则,粒径分布集中,胶原纤维束形态和胶原分子的二级结构保存良好。