“科研式”教学法在动物生理学课程教学改革中的探索与实践

动物生理学是我国动物医学和动物科学专业的核心基础理论课程,是研究生理条件下,即正常动物体的机能活动及其生命活动规律的学科,是生物学的重要分支,也是学术型研究生入学考试的专业课之一,因此,在本科教学过程中,具有十分重要的地位[1-3]。作为一门核心专业基础理论课程,主要培养学生全面系统掌握动物机体各个系统、器官和细胞的正常活动过程,尤其是各个细胞和器官之间,相互调控和作用,从而在复杂的外界环境中,维持正常生命活动的机制。不仅要让学生理解知识点,还要能够学以致用,解决生产实践中的实际问题。但在科学技术快速发展的今天,随着信息化和智能化的进一步普及,传统的动物生理学教学模式,很难满足当今高等教育所要求培养的,具有原创性思维和探索型的高素质人才的目标[4-5]。因此,“科研式”教学法在新形势下,针对动物生理学课程的教学改革显得极其重要,为培养具有创新性思维、勇于探索和富有创造能力的高素质人才,提供坚实的基础和保障。

布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测与功能富集性分析

为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌(Brucella)感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩(Venn)分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip 1基因相对表达量极显著降低(P<0.01);在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip 1基因的相对表达量极显著升高(P<0.01);对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3′非翻译区(3′UTR)结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip 1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3′UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。

布氏杆菌脂多糖的研究进展

布氏杆菌（Brucella）为革兰阴性胞内寄生球杆菌,可以感染牛、绵羊、山羊、猪、犬等哺乳动物和人,对畜牧业和人类健康危害严重。布氏杆菌脂多糖作为细胞膜的主要组成部分,是布氏杆菌最重要的表面抗原和刺激机体先天免疫的靶点,也是目前布氏杆菌致病分子机制研究和布氏杆菌病诊断、防控研究的热点之一。本文对布氏杆菌LPS的化学结构、生物合成及相关基因、脂多糖与机体天然免疫等方面的研究结果进行综述,以期阐释布氏杆菌的生存和致病机制,为布氏杆菌病的诊断和防控提供技术参考。

H5N1型禽流感NS1基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建

将H5N1型禽流感病毒NS1（non-structural protein 1）基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜、FCM和Western blot 3种方法检测NS1-EGFP融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选获取稳定细胞系。结果显示,NS1基因正确插入pEGFP-N1真核表达载体,NS1-EGFP融合蛋白读码框架正确;3种检测方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中能够表达;pEGFP-N1和NS1-EGFP稳定细胞系流式细胞仪检测,阳性率分别为95.74%和96.10%,Western blot检测结果发现,HEK293空白细胞和pEGFP-N1稳定细胞系未见任何条带,NS1-EGFP稳定细胞系在51 000处见特异性条带,综上说明稳定细胞系构建成功。本试验为进一步深入研究禽流感病毒NS1基因的生物学功能作铺垫。

羊种布氏杆菌介导巨噬细胞mmu-miR-146a-5p的差异表达及其靶基因的初步鉴定

羊种布氏杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)感染巨噬细胞后,运用高通量测序技术挖掘出mmu-miR-146a-5p差异表达。利用TargetScan和miRDB数据库分别进行mmu-miR-146a-5p靶基因的在线预测,结果分别有224和125个,利用韦恩分析发现,2个数据库的在线预测结果交集有70个;进一步利用PicTar数据库进行mmumiR-146a-5p靶基因的在线预测,并与韦恩分析结果取交集;转染mmu-miR-146a-5p mimics至巨噬细胞中,通过荧光定量PCR方法检测预测靶基因的相对表达量,发现Ptpra与Tfdp2表达量显著降低,结果初步表明,mmu-miR-146a-5p的靶基因为Ptpra与Tfdp2。该试验为进一步研究mmu-miR-146a-5p在羊种布氏杆菌感染巨噬细胞过程中的作用奠定了基础。

中国荷斯坦奶牛MD-2基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建

将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和Western-blot分别检测融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选,获取稳定细胞系。结果发现,目的基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码160个氨基酸。双酶切鉴定和测序结果均表明,MD-2基因编码区正确插入pEGFP-N1真核表达载体,读码框架正确,MD-2-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中,能够成功表达;极限稀释获取单细胞,用250?g/mL的G418筛选得到的细胞系,经流式细胞术和Western-blot检测,在pMD-2-EGFP稳定细胞系组,分子质量约为46 ku处,发现了特异性条带,而pEGFP-N1空载稳定细胞组,以及空白的HEK293细胞对照组,均未发现条带。综上所述,本研究成功构建了真核表达载体pMD-2-EGFP,并在HEK293细胞中能够成功表达;经极限稀释,并利用G418抗性筛选,成功获得了pMD-2-EGFP和pEGFP-N1稳定细胞系,这为进一步研究中国荷斯坦奶牛奶牛MD-2基因的生物学功能奠定基础。