家蚕微孢子虫极管蛋白2(NbPTP2)的表达、纯化和定位特征

【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。

虾肝肠胞虫的3种快速显微镜检查法

虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei是近年来备受关注的病原性微孢子虫,严重影响对虾生长,并在东南亚及我国大部分对虾主产区迅速蔓延,极大地制约对虾养殖业的健康发展.特异、快速、便利地确诊EHP感染,在对虾育种、育苗及养殖过程中具有重要意义.本研究基于微孢子虫的孢子具有高度折光性,孢壁结构含较厚几丁质层及碘化丙啶可穿透孢子活细胞膜的特性,开展虾肝肠胞虫的光学显微成像研究,展示普通光镜法、微分干涉差显微成像法、荧光增白剂(fluorescent brightener 28)染色法及与碘化丙啶(Propidium Iodide)共染的双色荧光法在虾肝肠胞虫快速光镜检测诊断中的应用.实验建立的双色荧光镜检法无需固定和洗涤,具有操作简便,无专业技术要求的特点,可在10 min内完成样品的初筛检测,为虾肝肠胞虫的早期筛查及养殖塘样品快速诊断提供价廉、省时且易操作的检测手段.